BULGULAR: Siklusun proeöstrus evresinde AQP7 ve AQP9 için alfa2 ve beta1 tanisit hücrelerinde yoğun bir
immunreaktivite belirlendi. Östrus evresinde herhangi belirgin bir boyanma izlenmezken, metöstrus evresinde
AQP9 için α
1
, α
2
ve β
1
tanisitlerde ve AQP7 için α
1
tanisitlerde çok zayıf bir immünreaktivite gözlendi. Diöstrus
evresinde ise α
2
, β
1
ve β
2
hücrelerinde AQP7 ve 9 için yoğun immun boyanmalar dikkat çekiciydi.
SONUÇ: Aquagliseroporinlerden AQP7 ve 9 farede östrus siklusunun farklı evrelerinde farklı boyanma örnekleri
sergilemektedirler. Bu farklılığın tanisitlerin ilişkili olduğu hipotalamik nükleuslar ve medyan eminansa bağlı
fonksiyonel farklılıklardan kaynaklanabileceğini düşündürmektedir.
Anahtar Kelimeler: AQP7, AQP9, Tanisit hücreleri, Östrus siklusu, Fare
Expression of aquaporin 7 (AQP 7) and aquaporin 9 (AQP9) proteins in tanycyte
cells during mouse estrus cycle
OBJECTIVES: Tanycytes are special ependymal cells located on the floor of the third ventricle having processes
extending deep into the hypothalamus. The aquaporins (AQPs) are a family of transmembrane proteins that
transport water. AQP7,9 are permeable to other small molecules as glycerol that are also called
aquaglyceroporins. In this study we hypothesized that AQP7,9 might play a role in glycerol transport in
tanycytes during female mice estrus cycle. The aim of the study was to evaluate AQP7,9 localization in
tanycytes during the estrus cycle.
MATERIALS & METHODS: Female Balb/c mice (n=12) were used. Estrus cycle stages were determined by
daily vaginal smears according to the ratio of cell types found in the smears. The stages of cycle were classified
into four categories: proestrus (n=3), estrus (n=3), metestrus (n=3), and diestrus (n=3). In order to
investigate whether these proteins participate in tanycytes by means of immunohistochemistry, the intensity of
the immunostaining was semi-quantitatively
evaluated.
RESULTS: We detected intense AQP7,9 immunostaining in α
2
and β
1
tanycytes in proestrus stage.
Interestingly, there was no staining in estrus stage. We also observed a weak immunoreactivity of α
1
, α
2
and β
1
tanycytes in diestrus stage for AQP7 and α
1
for AQP9 proteins. AQP7 and 9 showed intense immunoreactivity in
α
2
, β
1
and β
2
tanycytes during diestrus stage.
CONCLUSION: AQP7,9 showed different staining patterns corresponding to different stages of mouse estrus
cycle. Current study suggests that AQP7,9-mediated glycerol transport in tanycytes might be using glycerol as
a potential energy substrate during mouse estrus cycle.
Keywords: AQP7, AQP9, Tanycyte cells, Estrus cycle, Mouse
Poster Bildiriler / Poster Presentations
113
P20
Su ve gliserol transportunda rol alan Aquaporin 3 ekspresyonunun ventrikülüs
tertius tanisit hücrelerindeki immunlokalizasyonu
Ramazan Yavuz Arıcan
1
, Berna Sözen
2
, Gamze Tanrıöver
2
, Necdet Demir
2
, Bikem Süzen
1
1
Akdeniz Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Anatomi Anabilim Dalı, Antalya
2
Akdeniz Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Antalya
1
Akdeniz University, Faculty of Medicine, Department of Anatomy, Antalya, Turkey
2
Akdeniz University, Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Antalya, Turkey
AMAÇ: Su kanal proteinleri olarak bilinen aquaporinlerin (AQP) suyun transportunda önemli rol oynadıkları
belirlenmiştir. AQP0, AQP1, AQP2, AQP4 ve AQP5 sadece suya özgül proteinler olup; AQP3, AQP7 ve AQP8
büyük oranda suya aynı zamanda da gliserole geçirgendirler. AQP9 ise daha büyük moleküllerin transportunda
rol oynamaktadır. AQP3 sıçan böbreğinden klonlanmıştır ve böbrek medullar toplama kanallarının dorsolateral
membranında bulunan su kanalları olarak belirlenmiştir. Aynı zamanda sindirim yolunda, solunum epitelinde ve
konjuktivada da görülmektedir. Çalışmamızda, AQP3 üzerinde yoğunlaşılmış ve beyin omurilik sıvısı, hipofiziyel
portal pleksus ve hipotalamik kapillerler arası fiziki bağlantı kuran tanisit hücrelerinin α
1
, α
2
, β
1
, β
2
alt
tiplerindeki AQP3 ekspresyonunun ortaya konulması amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM: Çalışmada Balb-c ırkı yetişkin erkek (n=6) ve dişi (n=6) fareler kullanılmıştır. %4
paraformaldehid, %15 pikrik asit içeren fiksatifle perfüze edildikten sonra beyin kesilerek rutin parafin takibine
alınmıştır. Bloklardan alınan 5m kalınlığında kesitlerde AQP3 immünlokalizasyonu üçüncü ventrikülün duvarını
döşeyen tanisit hücrelerinin alt tiplerine göre değerlendirilmiştir.
BULGULAR: AQP3 ekspresyonu erkek farelerde sadece α
1
tanisitlerde görülürken, dişi farelerde α
1
ve α
2
, β
1
tanisitlerinde yoğun olarak gözlenmiştir.
SONUÇ: Çalışmamızın sonucunda fare üçüncü ventrikül duvarındaki tanisit hücrelerinde AQP 3 ekspresyonu
cinsiyete ve tanisit alt gruplarına göre değişiklik göstermektedir. Yapılacak yeni çalışmalar ve yeni tekniklerle
AQP3 ekspresyonunun dişi ve erkekler arasındaki bu olası farkının aydınlatılması amaçlanmaktadır.
Anahtar Kelimeler: AQP3, Ventriculus tertius, Tanisit
The immunlocalization of water and gliserol transport protein Aquaporin 3 in
ventriculus tertius tanycytes
OBJECTIVES: Aquaporins (AQPs), a family of proteins identified as water channels, play a role in fluid
transport. The subtypes of aquaporins AQP0, AQP1, AQP2, AQP4 and AQP5 are only specific to water. AQP3,
AQP7 and AQP8, are highly permeable to water, but are also transport glycerol and even larger solutes (AQP9).
AQP3 was cloned from rat kidney. AQP3 is the water channel in dorsolateral membranes of the renal medullary
collecting duct. AQP3 is also expressed in the gastrointestinal tract, airway epithelium and eye conjunctiva. In
our study we focused on AQP3 and the expression of AQP3 in the subtypes of tanycytes α
1
, α
2
, β
1
, β
2
around the
mouse third ventricle that interact with cerebrospinal fluid, portal plexus, and hypothalamic capillaries.
MATERIALS & METHODS: 6 male (n=6) and 6 female (n=6) adult Balb-c mouse were included in this study.
4% paraformaldehyde and 15% picric acid mixture solution was used for perfusion. After the perfusion, the
brain samples were harvested and the routine histological paraffing blocking was performed. The
immunlocalization of AQP3 were evaluated according to the tanycyte subtypes on 5m-thick slices of the third
ventricle wall.
RESULTS: The AQP3 expression was identified only in α
1
tanycytes in male and in α
1
, α
2
and β
1
tanycytes in
female mice.
CONCLUSION: As a result, the expression of AQP3 differs according to sex and tanycyte subtypes in the 3rd
ventricle wall. Through further studies and techniques, the reasons of the probable AQP3 expression difference
between male and female subjects would be elucidated.
Keywords: AQP3, Ventriculus tertius, Tanycytes
Poster Bildiriler / Poster Presentations
114
P21
Pea3 proteininin sinir hücre farklılaşmasıyla ilgili yeni hedef genlerinin
belirlenmesi
Uğur Dağ, Burcu Erdoğan, Berrak Çağlayan, Işıl Aksan-Kurnaz
Yeditepe Üniversitesi, Genetik ve Biyomühendislik Bölümü, İstanbul
Yeditepe University, Department of Genetics and Bioengieneering, Istanbul, Turkey
AMAÇ: Pea3 proteini ETS (E26 transcription-specific) Transkripsiyon faktörü ailesinden olup; sinirsel başkalaşım
ve sinirsel gelişim gibi biyolojik olayların yanı sıra metastatik tümör oluşumunda rol almaktadır. Ancak Pea3
proteininin bu görevleri hangi hedef genler aracılığıyla gerçekleştirdiği henüz bilinmemektedir. Bu çalışma, Pea3
için hedef oluşturan genlerdeki promotör bölgelerinin biyoinformatik olarak saptanmasını ve elde edilen
sonuçların laboratuvar koşullarında desteklenmesini amaçlamaktadır.
GEREÇ ve YÖNTEM: Pea3 için potansiyel hedef teşkil eden bölgeler çevrimiçi biyoinformatik araçlar vasıtasıyla
saptanmıştır. Daha sonra bu bölgelere özgü tasarlanan primerler aracılığıyla, belirlenen genlerin Pea3 varlığında
ve yokluğundaki anlatım farkları RT-PCR ve gerçek zamanlı RT-PCR teknikleriyle saptanmıştır.
BULGULAR: Yapılan çalışmalarla, yüksek olasılıkla Pea3 transkripsiyon faktörüne hedef oluşturan genler tablo
halinde listelenmiştir. Listedeki AMFR (Autocrine Motility Factor Receptor) ve Ephrin B2 genlerinin anlatımlarında
Pea3 varlığında ve yokluğunda değişiklikler gözlenmiştir.
SONUÇ: Elde edilen bulgular üzerinde yapılan değerlendirmeler sonucunda Pea3 proteinin sinirsel gelişimde rol
alan Ephrin B2 anlatımı üzerinde etkili olduğu düşünülmüştür. Bunun yanında Pea3 proteinin bir metastatik
işaretçi olan AMFR üzerindeki etkisi, bu proteinlerin embriyo gelişimi sırasında akson uzaması ile
ilişkilendirebileceği kanısını uyandırmıştır. Bu kapsamda yapılacak olan yeni çalışmalarla Pea3-Ephrin B2 ve
Pea3-AMFR ilişkilerinin daha detaylı bir şekilde incelenmesi amaçlanmaktadır.
Anahtar Kelimeler: Pea3, Transkripsiyon faktörü, Sinirsel gelişim, Sinirsel farklılaşma, Metastaz
Identification of novel Pea3 target genes related to neuronal differentiation
OBJECTIVES: Pea3 protein is a member of ETS family of transcription factor, taking roles in neuronal
differentiation and development in addition to metastasis. However, the targets of Pea3 transcription factor
have not been identified, exactly. This study comprises the identification of the promoter regions of possible
target genes for Pea3 and confirmation of the results in vitro conditions.
MATERIALS & METHODS: The possible target regions for Pea3 were scanned through online bioinformatics
tools. The differences in expression levels in the absence and presence of Pea3 were identified by RT-PCR and
qRT-PCR techniques.
RESULTS: The genes whose promoter regions are able to be target for Pea3 were tabulated in a table. AMFR
(Autocrine Motility Factor Receptor) and Ephrin B2 was selected for further examinations and their expressions
varied in the presence and the absence of Pea3.
CONCLUSION: It is thought that, Pea3 is effective for expression of Ephrin B2 which takes roles in neuronal
development. In addition to this, expression of AMFR which is metastatic marker and might be related to axonal
growth during neurogenesis, is possibly regulated by Pea3. Further studies are aimed to reveal detailed
information about Pea3-Ephrin B2 and Pea3-AMFR relationship.
Keywords: Pea3, Transcription factor, Neuronal development, Neuronal differentiation, Metastasis
Poster Bildiriler / Poster Presentations
115
P22
Pea3 transkripsiyon faktörünün (doğal tür ve fosforilasyon mutantlarının)
NeuroD geni aktivasyonundaki rolü
Burcu Erdoğan, Uğur Dağ, Berrak Çağlayan, Işıl Aksan-Kurnaz
Yeditepe Üniversitesi, Genetik ve Biyomühendislik Bölümü, İstanbul
Yeditepe University, Department of Genetics and Bioengineering, Istanbul, Turkey
AMAÇ: ETS (E26 transcription-specific ) ailesinin bir üyesi olan Pea3, bir fosfoprotein olup DNA üstünde 5’-
GGAA/T-3’ merkezli diziye bağlanarak hedef genlerin anlatımını sağlar. Çalışmamızda Pea3 proteinin hedef
genleri arasından, nöral farklılaşma ve gelişmede önemli olan genler hedef olarak seçildi ve Pea3 proteinin bu
genlerin anlatımındaki etkisi araştırıldı. Bunun yanısıra Pea3’nin fosforlanmasının transaktivasyon kapasitesine
olan etkisi araştırıldı.
GEREÇ ve YÖNTEM: Pea3 proteininin hedef genlerden biri olan ve nöral farklılaşmada rolü olduğu bilinen
NeuroD geni üstündeki aktivasyon kapasitesi nöroblatoma SH-SY5Y ve insan böbrek embriyonik HEK-293
hücrelerinde, lusiferaz raportör takip yöntemi ile araştırıldı. Aynı yöntem Pea3 fosforilasyon mutantlarının
aktivasyona olan etkisi içinde araştırıldı. Bununla beraber Pea3 proteinin NeuroD promotörü üzerindeki
bağlanma sekansları kromatin immünopresipitasyon yöntemi ile kesinleştirilecektir.
BULGULAR: SH-SY5Y ve HEK-293 hücrelerinde gerçekleştirilen lusiferaz takip çalışmalarında doğal tür Pea3
proteini varlığında artan NeuroD promotörünün aktivasyonu ile lusiferaz geni anlatımınında anlamlı şekilde
arttığı gözlemlenmiştir. Fosforilasyonun indüklenmesi ve susturulması ile oluşturulan mutasyonlarda ise
mutasyon oluşturulan S/P bölgesinin gen üstünde bulunduğu kümeye bağlı olarak gen anlatımında artma ve
azalmaya yol açtığı görülmüştür.
SONUÇ: Elde edilen bu sonuçlar ile NeuroD geninin Pea3 proteinin alt yolağında bulunabileceği ve bu genin
aktivasyonundaki etkisinin Pea3 proteinin farklı kümelerindeki fosforlanmasıyla artıp azalabileceği görülmüştür.
Anahtar Kelimeler: Pea3 transkripsiyon faktörü, NeuroD, Bölge hedefli mutasyon, Lusiferaz
Transactivation capacity of Pea3 transcription factor (wild type and
phosphorylation mutants) on promoter of Neurod
OBJECTIVES: Pea3, a member of the ETS (E26 transcription-specific) family of transcription factor is a nuclear
phosphoprotein capable of activating transcription of genes by binding to a core DNA sequence 5’-GGAA/T-
3’. Among many of its target genes we try to find the ones that regulate axonal growth, neuronal development
and differentiation and show its transactivation capacity over its target genes’ promoter. While transactivation
capacity of Pea3 was studying, we also investigate the upstream effectors of Pea3 such as kinases that
phosphorylates Serine/Proline sites on Pea3 protein and effects its transactivation capacity.
MATERIALS & METHODS: Promoter of target genes that are found posses putative Pea3 binding sites were
then prooved with luciferase reporter assay methods. SH-SY5Y (neuroblastoma ) and HEK 293 (human
embryonic kidney) cell lines were co-transfected with plasmids which includes NeuroD gene promoter that
controls the expression of luciferase reporter gene and flag tagged wild type and mutant Pea3 proteins. Among
many putative binding sites on a promoter the exact bindig site or sites will be determined by making site
directed mutagenesis (SDM) and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays.
RESULTS: Reporter assay analysis in SH-SY5Y (neuroblastoma) and HEK 293 (human embryonic kidney) cell
lines show that luciferase gene expression under control of NeuroD (neuronal differentiation) gene promoter
give significant increase in the presence of wild type Pea3 protein. Reporter assays are also performed with
Pea3 proteins that are mutant for the certain Serine/Proline phosphorylation sites. Mutations were designed so
to mimick or silence the phosphorylation. Mutations enhanced activation while some repressed and some did
not give any significant effect.
CONCLUSION: With the light of these studies, we found that NeuroD is a downstream target of Pea3
transcription factor and its activation is effected depending on phosphorylation status of Pea3 by its upstream
effectors; serine/proline tyrosine kinases. With NeuroD and other upcoming Pea3 targets we can further
propose a signaling pathway with downstream and upstream elements of Pea3 and their involvement in
regulation of neuronal development.
Keywords: Pea3 transcription factor, NeuroD, Site directed mutagenesis, Luciferase
Poster Bildiriler / Poster Presentations
116
P23
Pea3 transkripsiyon faktörünün fosforilasyon bölgelerinin tanımlanması
Berrak Çağlayan, Işıl Aksan-Kurnaz
Yeditepe Üniversitesi, Genetik ve Biyomühendislik Bölümü, İstanbul
Yeditepe University, Department of Genetics and Bioengineering, Istanbul, Turkey
AMAÇ: Bu çalışmanın amacı Pea3 transkripsiyon faktörünün fosforilasyon bölgelerinin tanımlanması ve bu
fosforilasyon bölgelerine özgü olası kinazların belirlenmesidir.
GEREÇ ve YÖNTEM: Pea3 proteini üzerinde biyoinformatik araçlar kullanılarak tahmin edilen fosforilasyon
bölgelerinde susturma mutasyonları oluşturulmuştur. Bu bölgelerin gerçek fosforilasyon bölgeleri olup olmadığı
ve hangi kinazlar tarafından fosforlandığı lusiferaz raporcu tayinler ile bu kinazlara özgü inhibitör maddeler
kullanılarak belirlenmektedir.
BULGULAR: Bugüne kadar laboratuvarımızda yapılan biyoinformatik çalışmalarında Pea3 proteininin hücrelerde
stres sonucu etkin hale geçen p38, proliferasyonda etkili olduğu bilinen MAPK, sinir hücreleri gelişiminde etkin
olduğu bilinen CDK5 ve hücre döngüsünde yer aldığı bilinen CDC2 gibi kinazlar tarafından fosforlanma
olasılığının yüksek olduğu bulunmuştur. Bu kinazlar ile Pea3 proteini arasındaki ilişkinin moleküler düzeyde
araştırılmasına devam edilmektedir.
SONUÇ: Pea3 proteini embriyonik gelişim sırasında nöron aksonlarının yön bulmasıyla ilgili olduğu kadar
kanserli hücrelerin agresifliği ile de ilişkilidir. Bu proteinin fosforlanmaya bağlı aktivasyon veya baskılanma
mekanizmalarının bulunması nörodejenerasyondan kansere kadar geniş çapta hastalıkların tedavisinde ilave bir
basamak olma hedefindedir.
Anahtar Kelimeler: Pea3, Fosforilasyon, Bölge hedefli mutajenez
Identification of phosphorylation site specific kinases on Pea3 transcription
factor
OBJECTIVES: The objectives of these study are identification of phosphorylation motifs on Pea3 protein and
determination of site specific kinases on these phosphorylation sites of Pea3 transcription factor.
MATERIALS & METHODS: Silencing mutations were constructed on the phosphorylation motifs on Pea3
protein that were predicted using bioinformatic tools. We identify whether these motifs are correct
phosphorylation sites or not and that which kinases phosphorylate these sites by using luciferase reporter
assays and inhibitor substances specific to these kinases.
RESULTS: To date, in bioinformatic studies carried on in our laboratory determined that there is a strong
possibility of phosphorylation of Pea3 protein by p38 through a stress driven pathway, MAPK known to be active
in proliferation, CDK5 known to be activated during neuronal maturation and CDC2 known to play a role in cell
cycle regulation. We continue our research on the relationship between these kinases and Pea3 protein on
molecular level.
CONCLUSION: Pea3 protein is associated with axonal pathfinding of neurons during embryonic development
as well as aggresiveness of cancer cells. Identification of phosphorylation dependent activation or repression
mechanisms of this protein is aimed to be a further step in various diseases related from neurodegeneration to
cancer proteinin.
Keywords: Pea3, Phosphorylation, Site directed mutagenesis
Poster Bildiriler / Poster Presentations
117
P24
Elk-1 ve mitotik proteinler arasındaki ilişkisinin incelenmesi
Oya Arı
1
, Özlem Demir
2
, Işıl Aksan-Kurnaz
1
1
Yeditepe Üniversitesi, Genetik ve Biomühendislik Bölümü, İstanbul, Türkiye
2
Max Planck Moleküler Hücre Biyolojisi ve Genetik Enstitüsü, Howard Laboratuvarı, Dresden, Almanya
1
Yeditepe University, Department of Genetics and Bioengineering, Istanbul, Turkey
2
Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, Howard Lab, Dresden, Germany
AMAÇ: Elk-1 ETS transkripsiyon faktörleri ailesinin bir üyesidir ve mitojenler tarafından aktive edilen MAPK lerin
fosforlamasına bağlı olarak transkripte olan mitozun öncül genleri ile ilişkilidir. Elk-1 in beyin tümörü
hücrelerinde ERK/MAPK ve PI3K aktivasyonuna yanıt olarak ekspresyonunun arttığı gözlenmiştir. Yakın
zamanda yapılan çalışmalar, nöronlarda Elk-1 in mikrotübüllerle etkileşim içerisinde olduğunu göstermiştir. Bu
çalışmada Elk-1 ile motor proteinleri ve CENP-E gibi mitotik proteinler arasındaki ilişkinin incelenmesi
amaçlanmıştır.
GEREÇ ve YÖNTEM: Elk-1 ve mitoz ilişkili proteinler arasındaki etkileşim glioblastoma ve nöroblastoma hücre
hatlarında immuno çökeltme ve western blotlama yöntemleri kullanılarak analiz edilmiştir.
BULGULAR: Elk-in erken mitoz safhalarında iğ ipliklerinde, özellikle kutuplarda, bulunduğu ve bu
lokalizasyonun sitokinez aşamasına doğru mitotik eksenin orta kısımlarına doğru kaydığı gözlemlenmiştir. Bu
nedenle bu çalışmada Elk-1 in CENP-E gibi mitotik proteinlerle olan ilişkisi ortaya çıkarılmaya çalışılmıştır. Bu
ilişkinin mekanizmasının ve fonksiyonel öneminin halen anlaşılamamış olmasına rağman, bu bulgular Elk-in
mitoz hücrelerinde potansiyel bir transkripsiyon dışı rolünü ortaya çıkarmıştır.
Dostları ilə paylaş: |