dəbiyyat
1.Qənbərov X.Q., Abişov R.A.,.Ibrahimov A.Ş. “Biotexnologiyanın əsasları”,
Bakı-1994,-284s.
2.Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: В 3-х т. – М.: Мир, 1988
3.Бациллы. Генетика и биотехнология. Под ред. Хервуда К. М.: Мир, 1992 г.
4.Бейли Дж., Омис Д. Основы биохимической инженерии (в двух частях). М.:
Мир
, 1989 г.
5.Березин И.В. Исследования в области ферментативного катализа и
инженерной
энзимологии: Избранные труды. – М.: Наука, 1990. – 384 с
6.Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – СПб: Изд-во фирма "Наука", 1995. –
600 с.
7.Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции. – М.: Высш.
школа
, 1989.
8.Квеситадзе Г.И. Введение в биотехнологию / Г.И. Квеситадзе, А.М.
Безбородов
. М.: Наука, 2002.
9. Клеточная инженерия/ Р.Г. Бутенко, М.В. Гусев, А.Ф. Киркин, Т.Г.
Корженевская
, Е.Н. Макарова. – М.: Высшая школа, 1987.
10. Сассон Альбер. Биотехнология: свершения и надежды. – М.: Мир, 1987. –
411 с
11. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия: Новосибирск: Сиб унив. Изд-во,
2004.-496с.
nsanvə heyvan hüceyrələrinin becərilməsi.
nsan
və
heyvan
hüceyrələrindən biotexnologiyada ilk dəfə 1949-cu ildə Amerika alimləri istifadə
etmişlər. Onlar poliomielit virusunu insane rüşeyminin becərilən əzələ və dəri
hüceyrələrində yetişdirmişlər.
Sonralar dünyanın bütün virosologiya laboratoriyalarında hüceyrə
kulturalarından geniş istifadə olunmağa başlandı.
nsan rüşeyminin və
meymunların böyrək hüceyrələri, toyuq embrionu hüceyrələri viruslara qarşı daha
həssas olub onların çoxaldılmasında tətbiq edilir. Hüceyrə kulturalarının tətbiqi
virusların təmiz şəkildə alınması və virus xəstəlikləri diaqnostikası və vaksinlərin
alınmasının inkişafına səbəb olmuşdur. Digər tərəfdən, heyvan və insanların
müvafiq orqanlarının hüceyrələri vasitəsilə sənayedə hormonal dərman
maddələrinin istehsalı da böyük əhəmiyyət kəsb edir.
Hormonal orqanizmdə differensasiya olunmuş xüsusi hüceyrələr tərəfindən
sintez edilir. Belə hüceyrələrin becərilməsi və onların fizioloji fəal maddələr sintez
edən hüceyrə xətləri-produsentlər alınmasında hələlik bir sıra çətinliklər
mövcuddur. Birincisi, differensasiya olunmuş hüceyrələr kultura mühitində çox pis
bitir və ya heç bitmir. kincisi, becərilmə şəraitindəki hüceyrələr toxumaya məxsus
spesifik maddə sintez etmək funksiyasını itirir. Üçüncüsü, çox vaxt kultura
mühitində spesifik funksiyalarını saxlamaqla bitən hüceyrələr bəd xassəli olur. Bu
isə onların praktikada tətbiqini məhdudlaşdırır. Nəhayət, uzun müddət becərilən
hüceyrələr kariotipikvə fenotikip dəyişkənliklərə məruz qalırlar.
Lakin bu sahədə müəyyən müvəffəqiyyətlərdə qazanılmış, məsələn, insan,
öküz və donuzun mədəaltı vəzi hüceyrələrinin kulturaları alınmışdır. Viruslara
qarşı universal təsir xassəsinə malik qlikoproteid interferonu sintez edən hüceyrə
kulturası yaradılmışdır.
nsanvə heyvan hüceyrələrini kultura mühitində becərməklə onlardan
produsent kimi istifadə etməyin çətinliyi əsasən faydalı xassələrin itməsi ilə
ə
laqədardır. Faydalı xassələrin itməsi aşağıdakılarla izah olunur:
1.
istifadə edilən qida mühitlərinin uyğunsuzluğu. Hüceyrə xətlərinibecərmək
üçünhazırlananqidamühitikiçikmolekulluinqradientlərdən
(tərkibhissələrindən)
təşkilolunurvə
invitro
şə
raitdə
tərkibindəkicüzimiqdardaspesifik
ə
lamətinekspressiyasını stimuledənnadirkomponentlərolmur;
2.
tənzimləyici amillər təsirinin uyğunsuzluğu. Standart qida mühitlərində
bioloji fəal maddələr (hormonlar, boy maddələri) mənbəyi kimi qan zərdabından
istifadə edilirki, bu da hücyrə xətlərinin qarşılıqlı təsiri nəzərə alınmadan qida
mühitinə əlavə edilir;
3.
becərilmə şəraitinin statikliyi. Hüceyrələrin becərilməsi uzun müddət qapalı
sistem üzrə qida mühiti və qaz fazasının sabitliyi şəraitində aparılır. Belə şəraitdə
qida mühiti komponentlərinin mənimsənilməsi və hüceyrə metobolitlərinin sintezi
hesabına mühit komponentləri daim fasiləsiz olaraq dəyişir;
4.hüceyrələrarası qarşılıqlı təsirin itirilməsi.
Hüceyrələri toxumdan ayırıb kulturaya köçürdükdə hüceyrələrarası əlaqə
pozulur, fermentlərin təsiri və mexaniki zədələnmələrdən hüceyrə qılafı dəyişir.
Təkrar becərilmə zamanı butəsirlərin gücü dahada artır, deməli, hüceyrə
kulturalarının orqanizmdəki şəraitdə uyğun kompleks mühitdə becərilməsi tələb
olunur. Bu isə hələlik biotexnologiyada həll olunmamış problem kimi qalır.
Digər vacib məsələ hüceyrə kulturalarının faydalı xassələrinin uzun müddət
qorunub-saxlanması məqsədilə hibrid hüceyrələrdən – hibridomadan istifadə
edilməsidir.
Hibridomanormaldifferensasiya
və
transformasiyaolunmuş
hüceyrələrin birləşməsindən alınır.
Hibrid hüceyrələri təkcə eyni orqanizm hüceyrələrindən deyil, müxtəlif
orqanizm hüceyrələrindəndə almaq olur. Məsələn: toyuq mioblastı və siçanın
miogen toxuması hüceyrələrin birləşdirilməsi nəticəsində alınan hibrid hüceyrələr
(hibridoma) normal differesiasiya olunur və siçan hüceyrələrinə məxsus xassələri
spesifik olaraq özündə saxlayır. Beləliklə, hibrid heyvan hüceyrələrinin köməyi ilə
müxtəlif fizioloji fəal maddələri (interferonlar, insulin, boy hormonu, somatostatin
və s.-nin) alınması həyata keçirilir. Lakin son illər ərzində fizioloji fəal maddələrin
sintez edən heyvan və insan hüceyrələri geniş tədqiq edilmişdir. Bu, ilk növbədə,
gen mühəndisliyi üsuluilə fizioloji fəal maddələr olan hormonları sintez edən
bakteriyaların yaradılması ilə əlaqədardır. Fizioloji aktiv maddələr heyvan
hüceyrələrinə nisbətən mikroorqanizmlərdən çox asanvə böyük səmərə ilə alınır.
Biotexnologiyada istifadə olunan monoklonal antitellər.
Limfosit (ağ
qan hüceyrələri) və bədxassəli miolem hüceyrələrinin birləşməsindən alınmış
hibrid hüceyrələr tərəfindən sintez edilən yüksək təmizliyə malik antitellərə
monoklonal antitellər deyilir.
Antitellərdən ibarət antizərdabın adi üsulla alınması yüksək təmizlikli
antigenlərin olmasını tələb edir. Homogen antigen alınması isə çox çətin və
mürəkkəb prosesdir. Heterogen antigenlər isə əsasən keyfiyyətsiz (tərkibində cüzi
miqdarda antitel olan) antizərdablar alınmasına səbəb olur.
Hibrid hüceyrələrə kultural mühitdə yüksək böyümə sürətinə malik olub,
təmiz spesifik antitellər sintez edirlər. Onların alınması üçün insan və siçanın
miolem hüceyrələri heyvan dalağı hüceyrələrinə birləşdirilir. Bu hüceyrələrin hər
biri ayrılıqda in vitro şəraitdə inkişaf etmək qabiliyyətinə malik olmadıqlarına
baxmayaraq, onlardan alınan hibridoma çox asanlıqla kultura mühitində bitir.
Sonra kultura mühitində bitən və antitel sintezedən hibrid hüceyrələr seçilərək
klonlaşdırılır, yəni həyat qabiliyyətinə və xüsusi spesifikliyinə malik antitel
sintezedən hibrid populyasiyası alınır.
Antitellərdən təbabətdə xəstəliklərin diaqnostikası və müalicəsində istifadə
olunur. nsanlarda kəskin leykozun müalicəsi məqsədilə monoklonal antitellər
klinikada artıq tətbiq olunur. Monoklonal antitellərin köməyi ilə in vitro şəraitində
ş
iş hüceyrələri məhv edilmişdir. Hazırda qrip viruslarına, paraqripə və quduzluğa
qarşı monoklonal antitellər alınmışdır.
Yad genlərin heyvan hüceyrələrinə köçürülməsi.
Genetik
mühəndisliyin inkişafı ilə əlaqədar olaraq tədqiqatçıların diqqətini becərilən
heyvani hüceyrələr cəlb etməyə başlamışdır. Belə hüceyrələrə yad genləri
transformasiya etmək və onun ekspressiyasına nail olmaq bütöv orqanizmə
nisbətən asandır.
Ə
ksər heyvani zülallar və onların virusları adətən yüksəkmolekullu ilkin
maddələr şəklində sintez olunur, sonralar hüceyrədəki spesifik proteolitik proseslər
nəticəsində yetkin formaya çevrilirlər. Bu proseslər yalnız heyvan hüceyrələrinə
xasdır. Digər tərəfdən, bəzi eukariot zülallar bakteriya hüceyrəsində sintez
olunduqda eukariot hüceyrələr üçün spesifik olan modifikasiyaya uğraya bilmirlər.
Məsələn: bakteriyalar tərəfindən sintezolunan insan interferonu molekulunda
qlikozidli hissə olmur. Bu nöqtəyi nəzərdən heyvan və insan hüceyrələrinin
becərilməsi mühüm əhəmiyyət kəsb edir.
Heyvan hüceyrələri xassələrinin genetik mühəndislik üsulu ilə
möhkəmləndirilməsi vektor sisteminin yaradılmasını tələb edir. lk dəfə təmiz
virus DNT-sinin becərilən heyvan hüceyrəsinə köçürülməsi 1959-cu ildə tədqiq
olunmuşdur. Müəyyən edilmişdir ki, heyvan hüceyrələri və polioma virusu DNT-ni
hipertonik məhlulda (0,5-1,0 M NaCl) saxladıqda DNT hüceyrəyə daxil olur.
DNT-nin hüceyrəyə daxil olması hipertonik duz üsulu adlanır.
Hazırda virus DNT-nin hüceyrəyə transformasiyasının müxtəlif səmərəli
üsulları məlumdur.
DEAE – dekstran üsulu.
Hüceyrə və virus DNT-si olan mühitə
dietilaminetilendekstran
(DEAE)
polikationunu
ə
lavə
etdikdə
DNT
transformasiyası xeyli sürətlənir. Transfeksiyanın səmərəliliyinə DEAE-dekstranın
qatılığı və molekul çəkisi təsir edir. DEAE – dekstranın transfeksiya prosesində
rolu tam öyrənilməmişdir. Lakin məlumdur ki, polikation DNT ilə birləşir və
hüceyrə daxililində onu nukleazaların parçalayıcı təsirindən qoruyur. Bu üsulla
yeganə mənfi cəhəti polikationun bəzi hüceyrə kulturaları üçün zəhərli olmasıdır.
Kalsium – fosfat üsulu. Adenovirus DNT-sinin hüceyrə transfeksiyasına
yuxarıda qeyd olunan üsulların heç biri təsir etmədiyindən yeni üsulun işlənməsi
tələbi yarandı. Hüceyrə və adenovirus DNT-si fosfat və CaCl2 olan mühitə daxil
edildikdə DNT transfeksiyası sürətlənir və onun səmərəliliyi 10 – 100 dəfə artır.
Bu üsulla DEAE-dekstran üsuluna nisbətən daha çox istifadə edilir.
Liposomların
köməyi
ilə
virus
DNT-sinin
transformasiyası.
Sintetik fosfolipid vezikulalar və ya liposomlardan heyvan hüceyrələrinə
müxtəlif dərman maddələrinin daxil edilməsində istifadə olunur. Alimlər müəyyən
etmişlər ki, liposomlar vasitəsilə nuklein turşularını da hüceyrəyə daxil etmək olur.
Bu üsulun üstünlüyü ondadır ki, liposom hüceyrə membranı ilə tez birləşdiyi üçün
liposoma daxil edilmiş DNT molekulu da çox asanlıqla hüceyrəyə keçir. Digər
tərəfdən, liposom DNT molekulunu nukleazalar təsirindən mühafizə edir. Buna
görə də başqa üsullara nisbətən o, böyük perspektivə malikdir. DNT mlekulunun
liposoma transfeksiyası liposomların morfoloji quruluşu, tərkibi və lipidlərin
miqdarından asılıdır. Prosesə eyni zamanda liposomla hüceyrənin inkubasiya
edildiyi şərait də böyük təsir göstərir. Buna görə də bu prosesin həyata keçirilməsi
yuxarıda göstərilən amillərin nəzərə alınmasını tələb edir və çətin başa gəlir.
Virus DNT-nin mikroinyeksiya vasitəsilə heyvan hüceyrəsinə daxil
edilməsi. Bu üsul ilk dəfə alman alimi Qresman tərəfindən irəli sürülmüşdür.
Xüsusi şüşə mikrokapilyarların köməyi ilə içərisində DNT molekulu olan məhlul
(10-8 mikrolitrə qədər) hüceyrəyə (nüvə və ya sitoplazmaya) inyeksiya (daxil)
edilir. Yapon alimləri isə mikroinyeksiya metodu əsasında deşikaçma üsulunu
hazırlamışlar. Bu zaman sərbəst hüceyrə DNT olan məhlula salınır, xüsusi
mikroiynə vasitəsilə deşilir və DNT molekulu məhlul ilə birlikdə hüceyrəyə daxil
olur. Bu üsulun üstünlüyü hüceyrənin istənilən nahiyyəsinə (sitoplazmaya və ya
nüvəyə) DNT molekulunun, çatışmayan cəhəti isə onun vasitəsilə çox da böyük
olmayan DNT molekulunun, hüceyrəyə daxil edilməsindən ibarətdir. Nəzərə almaq
lazımdır ki, iri molekullar mikroinyeksiya prosesi zamanı parçalanır.
Plazmidlər və DNT fraqmentlərinin becərilən heyvan hüceyrələrinə
daxil edilməsi.
Heyvan
hüceyrələrində
genlərin
klonlaşdırılması
və
ekspressiyası bakteriya hüceyrələrinə nisbətən çox çətin olmasına baxmayaraq
böyük əhəmiyyət kəsb edir. Hazırda becərilən heyvani hüceyrələrə həm həlqəvi
plazmid DNT, həm də xətti DNT fraqmenti kalsium-fosfat və DEAE-dekstran
üsulları ilə daxil edilir. 1980-ci ildən başlayaraq mikroiynə ilə deşikaçma üsulu da
tətbiq olunur.
Bakteriya plazmidinin heyvan hüceyrəsinə daxil etmək məqsədilə bilavasitə
keçirmə üsulundan da istifadə edilir. Bu üsulda E. coli bakteriyası hüceyrəsinin
sferoplastı heyvani hüceyrələrlə qarışdırırlar və keçiriciliyi artırmaq üçün
polietilenqlikol əlavə olunur. Üsulun üstünlüyü ondan ibarətdir ki, plazmidi
bakteriya hüceyrəsindən ayırmaq və təmizləmək tələb olunmur.
Yad genlərin eukariot hüceyrələrə daxil edilməsinin fiziki-kimyəvi metodları
da məlumdur. Heyvan hecyrələrini intensivliyi 5-10 kv/sm olan elektorik
impulsları vasitəsilə işlədikdə mühitdəki DNT molekulu asanlıqla hüceyrəyə daxil
olur.
Hibrid DNT molekullarının becərilən heyvan hüceyrələrində stabilliyi.
Yuxarıda qeyd etdik ki, eukariot hüceyrələrə yad genlərin daxil edilməsini müxtəlif
üsullarla aparmaq mümkündür. Lakin burada əsas məqsəd hüceyrəyə daxil olunan
genin stabilliyini təmin etməkdir. Dağsiçanı hüceyrəsinə daxil edilmiş E. coli
bakteriyası plazmidi replikasiyaya uğramadan parçalanır və 2 gündən sonra tam
yox olur.
Müəyyən edilmişdir ki, plazmid DNT heyvan hüceyrəsində o vaxt səmərəli
replikasiya uğrayır ki, ona tərkibində xromosom DNT-sinin replikasiyaya sahəsi
olan DNT fraqmenti birləşdirilsin. Beləliklə, heyvani hüceyrələrdə genetik
mühəndislik əməliyyatı apaqmaq üçün hibrid plazmidlərdən istifadə etməyin
məqsədəuyğunluğu sübut edildi.
SV-40 virusundan molekulyar vektor kimi istifadə olunması.
Heyvani hüceyrələrdə mikroorqanizmlərdən fərqli olaraq plazmidlər
müşahidə edilməyinə görə onlara yad genlər daxil etmək məqsədilə vektor kimi
yalnız virus DNT-sindən istifadə olunur. DNT-dən vektor kimi istifadə etmək üçün
onun genetik və biokimyəvi xüsusiyyətlərinin tədqiqi vacib şərtlərdən biridir. Onu
təmiz halda çoxlu miqdarda almaq və heyvan hüceyrələrinə transfeksiya vasitəsilə
daxil etmək üsulları da məlumdur. Buna görə də becərilən heyvan hüceyrələri üçün
ilk klonlaşdırma vektoru SV-40 virus əsasında alınmışdır. Virus ilk dəfə əntər
meymunların böyrək hüceyrələrindən ayrılmış, çox kiçik ölçüdə olub, iki zəncirli
həlqədən ibarətdir. Canlı hücyrədə həm sərbəst, həm də inteqrasiya olunmuş
(hüceyrə xromosomunun tərkibinə daxil edilmiş) şəkildə replikasiya uğrayır. SV-
40 virusunun molekulyar-bioloji xüsusiyyətlərinin hərtərəfli öyrənilməsi ondan
molekulyar vektorlar kimi istifadə olunmasına imkan verir.
Molekulyar vektor almaq məqsədilə istifadə olunan ikinci virus polioma
virusudur. O, siçan hüceyrələrində sərbəst replikasiyaya malik olub, hüceyrə
kulturalarında da fəaliyyət göstərir.
Heyvan hüceyrələrinə selektiv markerli genlərin daxil edilməsi.
Hüceyrəyə daxil edilmiş ekzogen genetik məlumat hüceyrədə sərbəst və ya
xromosoma inteqrasiya olunmuş halda ekspressiya olunarsa, təkcə hüceyrənin
genotipi deyil, həm də fenotipi dəyişir. Bu proses morfoloji və biokimyəvi
transformasiya yolu ilə aparılır.
Biokimyəvi transformasiya zamanı hüceyrə metobalizmində çox böyük
dəyişikliklərə yol verilmir, ona görə də yad genlərin heyvan hüceyrələrinə daxil
edilməsində bu üsuldan istifadə edilir. lk biokimyəvi transformasiya prosesini L.
Kraus nümayiş etdirmişdir. O, sümük iliyi hüceyrəsindən βα polipeptidini
sintezedən DNT-ni ayırmış və onu βs polipeptidini sintezedən becərilən sümük
iliyi hüceyrələri ilə qarışdırmışdır. Bu zaman becərilən hüceyrələr həm βα, həm də
β
s polipeptidlərini sintez etmək qabiliyyətinə malik olmuşlar. Lakin bu hüceyrə
klonlarının selektiv olmaması üzündən onları ayırmaq mümkün deyil. Hüceyrəyə
daxil edilən gen eyni zamanda asan seleksiya olunan xassə də daşımalıdır. Bu
məqsədlə dehidrofolatreduktaza fermentinin markerlənmiş hibrid molekullardan
(vektorlardan) istifadə olunur. Becərilən heyvani heceyrələr dehidrofolatreduktaza
fermentinin inkibitorunun (metotreksat antibiotiki) cüzi miqdarına belə çox
həssaslıq göstərirlər. Heyvani hüceyrəyə dehidrofoletreduktaza genini daxil
etdikdə, o, hüceyrə xromosomuna inteqrasiya olunur və hüceyrədə metotreksata
qarşı rezistentlik (davamlıq) yaradır. Beləliklə, bu genlə markerlənmiş hüceyrələr
tərkibində 0,1 mkq/ml metotreksat antibiotiki olan mühitdə bitdikləri üçün
asanlıqla seleksiya olunurlar.
Yad genlərin heyvan orqanizminə daxil edilməsi. Biokimyəvi
transformasiya yolu ilə becərilən heyvani hüceyrələrə yad genlərin daxil
edilməsinin geniş tədqiqi onların heyvan orqanizminə daxil edilməsi üçün də geniş
imkanlar açdı. Bu sahədə tədqiqat işləri bir neçə istiqamətdə davam etdirilir.
1.Ekzogen genin heyvan orqanizminə daxil edilməsi. Bu halda gen
orqanizmin daim çoxalan hüceyrələrinə keçirilir. Bu təcrübələr siçanın sümük iliyi
hüceyrələri üzərində aparılmışdır. Sümük iliyi hüceyrələrinə metotreksat
antibiotikə qarşı davamlılıq göstərən hüceyrə DNT-sini transformasiya etmiş və
sümük iliyini yenidən siçan orqanizminə daxil etmişlər. Belə siçanlara metotreksat
antibiotiki vurduqda onlar ölmürlər (metotreksat siçanlar üçün zəhərli olub onların
ölümünə səbəb olur). Bu onu göstərir ki, sümük iliyi hüceyrələrinə in vitro daxil
edilmiş genlər in vivo şəraitdə ekspressiya olunurlar. Bu üsul hər şeydən əvvəl
müxtəlif irsi xəstəliklərin müalicəsi (gen terapiyası) üçün böyük prespektivə
malikdir.
2.Ekzogen genin mikroinyeksiya vasitəsilə mayalanmış heyvan oositilərinə
(yumurtahüceyrələrinə) daxil edilməsi. Mayalaşmış heyvanın yumurta hecyrələrinə
mikroinyeksiya yolu ilə ekzogen DNT molekulu daxil edilir və sonra yenidən
heyvan balalığına yerləşdirilir. Ekzogen gen oosit hüceyrə genomuna inteqrasiya
olunur. Belə oositlər inkişaf edərək yaşlı heyvan orqanizmlərinə çevrilirlər.
Bunlara transgen heyvanların deyilir. Daxil edilmiş yad gen transgen heyvanların
həm somatik, həm də cinsi hüceyrələrində olduğu üçün nəsildən-nəslə ötürülür.
stənilən xassəyə malik heyvan cinsləri almaq məqsədilə bu üsula böyük ümid
bəslənilir.
3.Ekzogen genin liposomların köməyi ilə heyvan orqanizminə daxil
edilməsi. Venasına proinsulin gen olan liposom daxil edilmiş siçanın
qaraciyərlərində müəyyən müddətdən sonra insulin miqdarının artması müşahidə
edilmişdir. Deməli, yad gen qaraciyər və dalaq hüceyrələrinin genemuna daxil
olmuşdur. Bu üsulu bütün heyvanlara və o cümlədən insanlara tətbiq etmək
mümkündür.
Qeyd etmək lazımdır ki, bu sahədə anlaşılmayan məsələlər çoxdur və yaxın
gələcəkdə onların həlli biotexnologiyada böyük dəyişikliklərə səbəb olacaqdır.
Dostları ilə paylaş: |