İsim Okul Numarası

05.03. Littman Oxgall Agar

05.04. Beyin Kalp İnfusyon Agarı

05.05. Mısır Unlu Agar

05.06. Malt Ekstrakt Agar

05.07. Yulaf Unlu Agar

05.08. Patates Dekstroz Agar

05.09. Pirinçli Besi Yeri

05.10. Czapek Agar

05.11. Dermatofit Test Medium ( DTM )

05.12. Cysteinli Kanlı Agar

05.13. Salvin YP Ortam

05.14. Sabhi Agar Besi Yeri

05.15. Casitone Nişasta Agar

05.16. Thioglucolate Besi Yeri

05.17. Nitrat Redüksiyon Ortamı

05.18. Kanlı Agar

06. Diğer Test Ortamları ve Yöntemler

06.01. Kazein Agar

06.02. Peptonlu Su

06.03. Amonyum Nitrat Agarı

06.04. Üre Agar

06.05. Jelatinli Ortam

06.06. Tiamin, İnositol, Nikotinik Asit ve Histidine Gereksinim Testi

06.07. Tyrosine Testi

06.08. Kıl İnvazyon (Perforasyon) Testi (Keratinolizis)

06.09. Germ Tüp Testi

06.10. Dimorfik Mantarların Maya Formuna Dönüştürülmesi

07. Solüsyonlar

07.01. Potasyum Hidroksit ( %10 )

07.02. Parker Boyası + KOH

07.03. Gliserinli Potasyum Hidroksit

07.04. Lakto Phenol Pamuk Mavisi (Aman's Solusyonu)

07.05. Polivinil Alkol Solusyonu

08. Boyalar

08.01. Gram Boyama Yöntemi (Hucker Modifikasyonu)

08.02. Kinyoun'un Boyama Yöntemi

08.03. Ziehl Neelsen Boyama Yöntemi

08.04. Giemsa Boyama Yöntemi

08.05. Periodik Asit Schiff ( PAS ) ile Boyama

08.06. Gridley Boyama Yöntemi

08.07. Akridin Oranj Boyası

09. Antifungal İlaçlar (Antifungal Kemoterapötikler)

01. Giriş

Mantar kolonilerinin makro-ve mikro morfolojilerini kolay ve ayrıntılı inceleyebilmek için önce bunlardan preparatlar hazırlamak ve sonra bu preparatları, ya natif olarak veya uygun boyama yöntemleri ile boyayarak muayene etmek gereklidir. Preparatların hazırlanmasında aşağıdaki tarzda hareket edilir:

02. Kutan Mikozeslerde

Dermatofitozise neden olan mantarların identifikasyonunu sağlamak için preparat, hem laboratuara gönderilen marazi maddelerden ve hem de üremiş olan kolonilerden hazırlanır.

Mikroskopik muayenelerde kullanılacak lâm ve lâmellerin çok iyi temizlenmiş olması, çizgili ve yağlı olmaması gereklidir. Bu amacı gerçekleştirmek için lâmlar devamlı olarak, ağzı iyice kapatılmış ve içinde alkol (% 96) bulunan kaplarda muhafaza edilirler. Kullanılacağı zaman, lâmlar bir pensle tutularak çıkarılır ve alkol kuruduktan sonra yağsız ve tüysüz bir bezle iyice silinir ve alevde hafifçe ısıtılır.

Kolonilerden materyal alırken çok yavaş hareket etmeli ve orijinal morfolojilerini bozmamaya çalışılmalıdır. Materyal, koloniler oluştuktan sonra ve en iyisi olgunlaşma döneminde iken ve koloninin çeşitli yerlerinden alınmalıdır. Mikroskopta iyi bir görünüm elde edebilmek için, uygun bir kontrast sağlanır. Preparat önce küçük büyütme(100-200 x) ve sonra daha yüksek büyütme (450-500 x) ile muayene edilir. Gerekli hallerde immersiyon objektifi de kullanılabilir.

02.01. Potasyum Hidroksit (%10)

Potasyum hidroksit veya Sodyum hidroksit, kıl, tüy, deri ve tırnak kazıntılarını muayenede, materyaldeki debrisleri hidrolize etmek ve materyali berraklaştırmak amacı ile kullanılır. Fungal elementleri iyice görebilmek için, lamdaki preparat hafifçe ısıtılır ve oda ısısında 30-60 dakika bekletilir. Eğer, çok fazla preparat hazırlanacaksa, bu takdirde % 5 KOH veya NaOH solusyonu kullanılır ve preparatlar bir gece bekletildikten sonra mikroskopta muayene edilirler. Preparatlar aşağıdaki tarzda hazırlanır.

1- Temiz ve kuru bir (veya birkaç) lâmın ortasına bir veya iki damla %10 KOH (veya %10 NaOH) solusyonundan damlatılır.

2- Bu solusyonun üzerine, steril bir pensle tutularak alınan yeterince materyalden konur.

3- Lâmelle kapatılır.

4- Alevde çok hafifçe ısıtılır (50oC - 60oC 'de, hiç bir zaman kabarcık çıkmamalı veya kaynatılmamalıdır.)

5- Preparat oda ısısında 30-60 dakika bekletilir. Eğer, alevde ısıtılmış ise, bu süre daha kısa olur.

6- Preparat, önce 100 veya 200 büyütme ile ve sonra da 450-500 büyütme ile muayene edilir.

02.02. Lacto Phenol Pamuk Mavisi

Bu yöntemle muayene, genellikle, kültürlerden yapılır. Solusyonun içindeki laktik asit özellikle mantar elementlerinin muhafazasında, fenol mantarların öldürülmesinde ve pamuk mavisi (anilin mavisi) de boyamada görev alarak iyi bir görünüm sağlarlar.Preparat aşağıdaki tarzda hazırlanır.

1- Temiz ve kuru bir lâmın ortasına bir veya iki damla lacto phenol pamuk mavisi solusyonu damlatılır.

2- Steril iğne ile, koloninin bir kaç yerinden materyal alarak, bu solüsyon üzerine konur.

3- Üzeri temiz bir lâmelle kapatılır.

4- Preparat önce, 100-200 ve sonra da 450-500 büyütme ile mikroskop altında muayene edilir.

Eğer lâmelin etrafı oje ile veya buna benzer madde ile kapatılırsa, uzun, süre muayene olanağı sağlanır. Mikroskopik muayenelerde iyi bir sonuç alınamazsa, o zaman başka bir koloniden materyal alınır. Eski kolonilerde kenarlardan ve genç kolonilerden de orta ve ortaya yakın yerlerden örnek alınarak muayene edilmelidir. İyi bir sonuç alınmadığı hallerde lugol solusyonu veya %10 KOH ile Parker boyası karışımı kullanılabilir.

02.03. Lâm Kültürü Hazırlama

Bu teknik, dermatofitlerin iyi tanınması ve teşhisi yönünden uygulanır. Aynı zamanda, saprofitlerle patojenik mantarların ayrımında da büyük yararlar sağlar. Lâm kültürü aşağıdaki tarzda hazırlanır:

1- Bir tüpte eritilmiş ve 45-50oC 'ler arasına kadar ılıklaştırılmış olan SDA (veya patates dekstroz agar, v.s.) steril temiz bir lâm üzerine ince tabaka şekilde dökülür.

2- Agar içeren lâm, steril boş bir petri kutusunda bulunan (U) veya (V) şeklindeki bir cam borunun üzerine yerleştirilir.

3- Lâm üzerindeki besi yerine, mantar elementlerinden (sporlar, koloni parçaları, miselyum, v.s.) ekilir.

4- Petri kutusunun yanlarına steril distile suya batırılmış pamuk yerleştirilir (veya gliserinli su).

5- Petri kutusunun kapağı kapatılarak uygun ısıda (25°-27°C) ve 4-8 gün inkubasyonda tutulur (koloniler iyice belli oluncaya kadar).

6- Bu sürenin sonunda, kültür kuru bir etüvde 37°C'de 24 saat bırakılır.

7- Lâm, petri kutusundan çıkarılarak, mikroskop altında muayene edilir. Ancak tehlikeli bir mantar üremesinden şüphe edilirse, bu zaman, kültür % 40 formol buharı ile 2 gün muamele edilerek öldürülür ve sonra muayene edilir.

Yukarıda bildirilen lâm kültürü lakto fenol pamuk mavisi ile de boyanarak muayene edilebilir. Bunun için yukarıdaki işlemler aynen uygulandıktan sonra aşağıdaki tarzda hareket edilir.

02.04. Rivalier Seydel Yöntemi

1- Lâm üzerinde koloniler üredikten sonra, agar üzerine, kollodyum 1 ml.+ absolut alkol 2 ml.+ sülfürik eter 2 ml. den oluşan karışımdan kaplayacak miktarda dökülür.

2- Lâm dik tutularak fazla gelen solüsyon aktarılır ve böylece 24 saat bekletilir.

3- Lâm sonra, lakto fenol pamuk mavisi ile 10-15 dakika boyanır.

4- Preparat, %70 alkole daldırılarak fazla boya giderilir.

5- Alkol (% 95’lik) içinde 3-5 saniye dehidre edilir.

6- Aseton (susuz) içine 3-5 saniye daldırılır.

7- Aseton + alkol (1 / 1) veya aseton + toluol (1 / 1) içinde 15 saniye tutulur.

8- Ksilol veya toluol içinde 10 dakika tutulur.

9- Kanada balsamına yatırılır ve mikroskop altında incelenir.

02.05. Agar Blok Yöntemi

Mantarların morfolojilerinin incelenmesinde ve birbirlerinden ayrılmasında çok kullanılan bir yöntemdir.

1- Eritilmiş SDA (veya diğer katı besi yerleri) steril bir petri kutusuna ince bir tabaka (2-3 mm. kalınlıkta) halinde dökülür ve katılaşması beklenir.

Yanda gösterilen tarzda hazırlanır.

2- Üzerinde, steril ve keskin bir bistüri ile 10 X 10  mm. boyutlarında bloklar çizilir.

3- Bunlardan bir tane, steril bir pensle tutularak, steril bir lâmın üzerine ( ortasına ) yerleştirilir.

4- Bu agar içeren lâm, steril petri kutusunda bulunan (U) veya (V) şeklindeki cam borunun (veya cam çubuğun) üzerine yerleştirilir.

5- Agar bloğun kenarlarının orta yerine ekimler yapılır.

6- Agar bloğun üzerine lâmel kapatılır.

7- Petri kutusunun içine, distile suya batırılmış pamuk konur (veya %20 su + %80 gliserin karışımı).

8- Kapak kapatıldıktan sonra, 25-27 °C' de 4-8 gün inkubasyonda tutulur (koloniler iyice görülünceye kadar). Petri kutusu mikroskop altına konarak üreyen mantar kolonileri incelenirler.

9- Bu sürenin sonunda, agar bloğun üzerindeki lâmel bir pensle tutularak kaldırılır.

10-Lâmelin mantarlı yüzü üzerine bir damla % 96'lık alkol konur ve bunun mantar kolonileri üzerine yayılması sağlanır. Tam bir kuruma elde edildikten sonra, lâmel, temiz bir lâm üzerinde bulunan lakto fenol pamuk mavisi solusyonuna, mantarlı yüz alt tarafa gelecek tarzda, yatırılır.

11-Preparat mikroskop altında incelenir (fazla boya solusyonu akıtıldıktan sonra etrafı oje ile kapatılabilir).

Geride kalan agar bloğu, üzerinde lakto fenol pamuk mavisi olan lâm üzerine tersine döndürülerek yatırılır ve üzerine lâmel kapatılır. Preparat mikroskop altında incelenir.

03. Subkutan ve Sistemik Mikozeslerde

Bu mantar infeksiyonlarının teşhisinde, laboratuara gönderilen çeşitli materyallerden ve kültürlerden olmak üzere preparatlar hazırlanır. Bunlarda ya boyamadan veya çeşitli boyama yöntemler ile boyanarak muayene edilirler.

03.01. Muayene Materyallerinden

Laboratuara gönderilen materyallerden (çeşitli eksudatlar, irinler, vücut sıvıları, lezyonlu doku ve organ parçaları, vs.) biri aynen Dermatofitozislerde olduğu gibi, %10 KOH (veya %10 NaOH) ile, diğeri ise, negatif boyama yöntemleri ile (İndia boyası) muayene yapılmak üzere preparatlar hazırlanır ve mikroskop altında incelenir. Bunun yanı sıra, bakteriyolojide kullanılan tekniklere uyularak, preparatlar hazırlanır ve bunlar çeşitli boyama yöntemleri ile (Gram, Giemsa, PAS, Ziehl- Neelsen veya Kinyoun asit -fast boyama tekniği, Methanamine AgNO3, AO “acridin oranje”, vs. boya yöntemleri) boyanarak mikroskop altında immersiyonla muayene edilirler.

03.02. Doku Kesitleri Hazırlamak

Lezyonlu doku parçaları veya biyopsi materyallerinden de, usulüne uygun olarak doku kesitleri yapılır ve bunlar da yukarıda bildirilen boyama yöntemlerinden biri veya ikisi ile ayrı ayrı boyanarak incelenirler. Doku seksiyonlarını boyamada, yukarıdakilerin yanı sıra, Gridley, Musicarmine ve HE boyaları da kullanılabilir.

03.03. Kültürlerden Preparat Hazırlamak

Laboratuara gönderilen patolojik materyaller, şüphelenilen hastalığın karakterine göre bir veya izolasyon şansını artırmak için iki veya daha fazla besi yerlerine, usulüne uygun olarak ekilir. Uygun bir ısı ve inkubasyon süresinden sonra, üreyen mantar kolonilerinden çok dikkatli davranmak kaydıyla, preparatlar hazırlanır ve mikroskop altında incelenir. Kolonilerden hazırlanan preparatlar, duruma göre lakto fenol pamuk mavisi, Giemsa, Ziehl-Neelsen, vs. boyama yöntemleri ile boyanarak mikroskop altında muayene edilirler.

04. Deneme  Hayvan İnokulasyonları

Deneme hayvanları, infeksiyon etkeninin özelliğine göre seçilir ve kullanılır. Bu hayvanlara, daha ziyade, teşhis amacı ile inokulasyonlar yapılabilir.

Deneme hayvanlarına, ya infekte materyallerden veya üremiş şüpheli kolonilerden, çeşitli yollarla şırıngalar uygulanır. Deneme hayvanı olarak kobay, tavşan, rat, fare veya bazen de büyük hayvanlar da işe yararlar. Denemelerde eğer mümkünse 2-3  hayvan kullanılmalıdır. Çünkü, mantar infeksiyonlarına karşı hayvanların duyarlılıkları, genellikle, değişiktir. Denemelerde beyaz veya özellikle, albinöz hayvanların kullanılmaları, sonuçları değerlendirme bakımından yararlar sağlayabilir. Deneme hayvanları her bakımdan sağlam ve derilerinde her hangi bir lezyon bulunmamalıdır.

04.01. Kutan Mikozesler

1-Klinik materyal inokulasyonu : Laboratuara teşhis amacı için gönderilen infekte (veya şüpheli) kıl, tüy, deri kazıntısı, vs. materyal çok az miktar SDA ile karıştırılır. Uygun deneme hayvanının karın veya yan tarafındaki bu amaç için hazırlanmış (5x5cm. alanındaki yerin kılları kesilir, derisi traş edilir ve ılık su ile iyice temizlenir, silinir ve kurutulur. Bu işlemler sırasında deriye zarar verilmemeye çalışılır ve deri kanatılmaz veya yaralanmaz. Eğer hayvan büyükse, daha geniş saha inokulasyon için hazırlanabilir) deriye cam çubukla bastırmak suretiyle sürülür. Birçok hastalık etkenleri bu yolla deneme hayvanlarını infekte edebilir ve lezyonlar oluşturabilir.

2- Kültür inokulasyonu: Uygun olarak seçilen deneme hayvanının karın ve yan tarafından derisine, yukarıda bildirilen tarzda hazırladıktan sonra, kanatılmamak kaydıyla, zımpara kağıdı ile skarifikasyon yapılır. Fizyolojik su ile yoğun suspansiyonu yapılmış kültür veya bala karıştırılmış kültürler, cam bir çubukla bastırarak deriye sürülür. Hayvanların ekserisinin derisinde, inokulasyondan 3-5 gün sonra kızarıklıklar ve lezyonlar görülmeye başlar. Bir hafta sonra, infeksiyon etkeninin karakterine göre, bölgede ödem oluşur ve eksudat sızıntısına rastlanır. Bu eksudat, zamanla, sarı-beyaz bir kabuk oluşturarak kurur. Bazen, deride meydana gelen bu reaksiyon, daha şiddetli olabilir ve nekrozlar oluşturabilir.

Gelişmiş lezyonlardan alınan materyallerden, mikroskopik muayeneler, ekimler ve gerektiğinde histopatolojik yoklamalar yapılabilir. Deneme için genç kültürler tercih edilmeli (3-4 haftalık) ve eski kültürler de tazelendikten sonra kullanılmalıdırlar. Genellikle, aerial hifaları olmayan kolonilerden alınan inokulumlar başarısız sonuç vermektedirler.

Lezyonların oluşumu (erken veya geç) ve lezyonların karakteri inokule edilen mantarın türüne bağlıdır. Yeni izole edilmiş ve fazla spor oluşturan suşlar, kısa süre içinde lezyon meydana getirebilirler. Lezyonların oluşumu yönünden hayvanlar arasında bazı farklar olabilir. Bu nedenle böyle durumları hesaba katarak en azından 2 deneme hayvanı kullanmak yerinde olur.

Aşağıdaki çizelgede bazı dermatofitlerin, kobaylarda patojenite durumları gösterilmiştir.

04.02. Subkutan ve Sistemik Mikozesler

Bu mantarların teşhisi için kullanılan deneme hayvanlarının seçimi (hayvanın  türü, cinsi, yaşı) ve inokulasyon yolları bazı değişikliklerle birlikte Dermatofitlere ait kısımda bildirildiği gibidir. Mantarların türüne göre kullanılacak deneme hayvanı aşağıda gösterilmiştir.

Sporotrichum schenkii : Bu etkenin maya veya miselyal formundan hazırlanan suspansiyondan 0.3ml. farelerin testisleri içine şırınga edilir. Testislerde oluşan lezyonlardan hazırlanan preparatlar Gramla boyanarak mikroskop altında incelenir. Mikroskopta tomurcuklu veya tomurcuksuz hücreler aranır.

Blastomyces dermatitidis : Bu mantarın sporlarından veya maya benzeri kolonilerinden hazırlanan suspansiyondan %5 gastrik mucin ile aynı miktar karıştırıldıktan sonra, farelere i.p., 1 ml. verilmesi halinde infeksiyon meydana gelmektedir. Eğer ölüm olmazsa, hayvanlar iki hafta sonra öldürülür, oluşan veya görülen lezyonlardan preparatlar hazırlanarak lakto fenol pamuk mavisi ile boyanırlar ve mikroskop altında muayene edilirler.

Candida albicans : Bu mantarın 24-48 saatlik kültüründen hazırlanan %1 lik  suspansiyondan (fiz su ile) tavşanların kulak venası içine 1 ml. şırınga edilir. Hayvanlar genellikle, 3-5 gün içinde ölürler. Böbreklerde oluşan küçük apse odaklarından elde edilen materyallerden preparatlar hazırlanır ve bunlar Gram yöntemi ile boyanırlar.

Gastrik mucin ile eşit miktarda karıştırılmış C. albicans, farelere karın içi olarak 1 ml. miktarında şırınga edilebilir.

Coccidioides immitis: Bu mantara ait kolonilerden suspansiyon hazırlanırken çok dikkat edilir. Fizyolojik su ile kobayların testis içi 0.5 ml. şırınga edilir. İnokulasyondan 7-10 gün sonra kobaylarda orşitis meydana gelir. Bu anda, hayvan öldürülür ve testislerde oluşan apse odaklarından preparatlar yapılır ve sporangiumlar yönünden incelenir. Mantarın artrosporlarından veya miselyumlarından hazırlanan suspansiyondan eşit oranda % 5 gastrik mucin ile karıştırıldıktan sonra 1 ml. miktarının karın içi kobaylara şırıngası lezyonların oluşmasına neden olabilir.

Cryptococcus neoformans : Bu mantarın 4-5 günlük kültüründen hazırlanan suspansiyon farelere beyin içine 0.03 ml. miktarında şırınga edilir. İnokulasyondan 10-12 gün sonra, hayvanın başı şişer ve fare ölür. Eğer ölümler meydana gelmezse hayvanlar ikinci hafta içinde öldürülür. Beyinde oluşan jelatinöz materyalden, India boyası ile preparat hazırlanır ve mikroskopta muayene edilir. Mikroskop altında kapsüllü yuvarlak hücreler aranır. Koloniden hazırlanan suspansiyonlardan 1 ml. karın içi olarak da verilebilir.

Histoplasma capsulatum : Bu etkenin BHI agar da üretilmiş maya benzeri formundan hazırlanan suspansiyon 8-10oC'de 2-3 saat tutulduktan sonra, farelerin kuyruk venasına 0.2 ml. miktarında şırınga edilir. Eğer hayvanlar bir hafta içinde ölmezlerse, farelerden biri veya ikisi öldürülür. Farelerin kanından, karaciğer ve dalağın kesit yüzlerinden preparatlar hazırlanarak Giemsa veya Wright boyama yöntemi ile boyanırlar.

Miselyal formunu, maya formuna döndürmek için, miselyal fragmentlerden veya sporlardan yoğun bir suspansiyon hazırlanarak farelere karın içi 1 ml. şırınga edilir. Ölen veya iki hafta sonra öldürülen farelerin dalak ve karaciğerinden preparatlar hazırlanır ve Giemsa ile boyanarak mikroskop altında incelenir. Mikroskopta küçük, oval ve tomurcuklu hücreler aranır. Organlardan, tüpteki BHI agara ekimler yapıldıktan sonra 37°C'de inkube edilirse maya benzeri formlar elde edilir.

Nocardia asteroides : Mantar suspansiyonu eşit miktarda gastrik mucin ile karıştırıldıktan sonra kobaylara karın içi 1 ml. şırınga edilir. İki hafta içinde ölen hayvanların dalak ve karaciğerlerindeki lezyonlardan preparatlar hazırlanır ve Kinyoun boyama yöntemi ile boyanarak mikroskop altında incelenirler.

05. Bazı  Besi  Yerleri

Mantarları üretmede kullanılan besi yerleri genellikle az sayıdadır. Bunlar da izolasyon ve özel besi yerleri olmak üzere 2 kısma ayrılabilirler. Ancak, bu ortamlar birbirinin yerlerine kullanılabilirler. Mantarları izole ve identifiye etmede yararlanılan başlıca besi yerleri şunlardır: Aşağıda belirtilen izolasyon ve identifikasyon besi yerleri, ticari firmalardan da, aynı amaçlar için temin edilebilir ve kullanılabilirler.

05.01. Sabouraud Dekstroz Agar

Patojenik mantarların ve dermatofitlerin izolasyonunda ve üretilmesinde en çok kullanılan bir ortamdır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır:

Pepton                             10.0  g.             

Et ekstraktı                        3.0 g.

NaCl                                   5.0 g.

Agar                                 17.0 g.

Distile su                        1000.0 ml.

Yukarıdaki maddeler distile suya konur, alttan ısıtılarak ve karıştırılarak eritilir. Otoklavda 120°C de 20 dakika sterilize edildikten sonra içine, katılır

Dekstroz                             40.0  g. (filtrasyonla sterilize  edilir)

Maya özeti                          3.0   g            

Tiamin                                 0.05 g.

Kloramfenikol                     0.04 g.

Aktidion (cyclohexamide)  0.5 g.

ve iyice karıştırılır. Ancak, kloramfenikol ve aktidionun özel olarak hazırlanması gereklidir. Bu amaçla, kloramfenikol 10 ml. % 70'lik alkolde ve aktidione de 10 ml. asetonda eritildikten sonra ilave edilir ve iyice karıştırılır. Eğer kloramfenikol bulunmazsa bunun yerine penisilin 20 U.I /ml. ve streptomisin 40 mcg. /ml. kullanılabilir. Besi yeri petri kutusunda veya tüp içine hazırlanır.

Bileşiminde bulunan aktidion (cyclohexamide) C. neoformans, Allescheria boydii, A. fumigatus,Candida krusei, C. tropicalis, C. parapsilosis, N. asteroides gibi mantarların üremelerini inhibe edebilir. Bu nedenle, bu etkenlerin izolasyonunda besi yerlerine antifungal madde katılmamalıdır. Dermatofitlere etkisi olmadığından, bunları izole etmede bu besi yerlerinden yararlanılır.

Aynı besi yeri aktidionsuz ve antibiyotiksiz olarak da saf kültürlerin devam ettirilmesinde kullanılır.

05.02. Sabouraud Glukoz Buyyon

Candida türlerinin ayrımında kullanılır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır.

Glukoz                        20.0  g.

Pepton                        10.0  g.                                      

Distile su                   I000.0 ml.

pH                                 5 .7

Maddeler distile suda ısıtılarak eritilir ve tüplere 10 ml. miktarında taksim edildikten sonra otoklavda sterilize edilir.

05.03. Littman Oxgall Agar

Bu besi yeri de patojenik bazı mantarların ve dermatofitlerin izolasyonunda kullanılır. Ancak, H. capsulatum, Nocardia ve Actinomycetesler için uygun değildir. Aşağıdaki tarzda hazırlanır:

Pepton                        10.0   g.

Glukoz                        10.0. g  (filtrasyonla sterilize  edilir)        

Oxgall (Bacto)             15.0   g.

Agar                           20.0   g.

Crystal violet                0.01  g.

Distile su                 1000.0    ml.

Yukarıdaki maddeler 1 litre suya konur, karıştırılır ve ısıtılarak eritilir. Otoklavda 120 ° C'de 20 dakika sterilize edildikten ve 45-50 °C'de ılıklaştırıldıktan sonra streptomisin 30 mcg. /ml. ve sterilize edilmiş glukoz katılır ve iyice karıştırılır. Petri kutusu veya tüplere taksim edilir.

05.04. Beyin Kalp İnfusyon Agarı

Bu ortam, A. israelii ve A. bovis ’in izolasyon, üretimi ve aynı zamanda H. capsulatum ile B. dermatitidis’in oda ısısında izolasyonu için de kullanılır.

Aşağıdaki tarzda hazırlanır:

Beyin-kalp infüsyonu                   37.0   g.

Kloramfenikol                                 0.05  g.

Cyclohexamide                              0.05  g.

Agar                                          20.0    g.

Distile su                                 1000.0   ml.

Besi yerinin bileşimine giren aktidion ve kloramfenikol, Sabouraud dekstroz agarda bildirilen tarzda hazırlandıktan sonra, katılır. Besi yeri petri kutularına veya tüplere taksim edilerek kullanılır. Bu besi yerine % 10 kan katılarak üretme özelliği artırılabilir.

05.05. Mısır Unlu Agar

Bu ortam C. albicans ’ta klamidospor oluşturmak, Streptomycetesleri, perithecia veya pycnidia oluşturan mantarları üretmede kullanılır. Aşağıdaki tarzda hazırlanır:

Mısır unu                40 .0 g.

Agar                        15.0   g

Distile su              1000.0   ml

Mısır unu 500 ml. distile suya konarak karıştırılır, kaynatılır, eritilir ve süzülür. Sonra içine 500 ml. suda ayrıca eritilmiş olan agar katılarak iyice karıştırılır. Tekrar süzülür. Otoklavda 120oC'de 20 dakika sterilize edilir, tüplere taksim edilir. Besi yerine %2 glukoz ve % 2 pepton katılabilir.

Bu ortama, % 1 Tween-80'in katılması klamidospor oluşumunu ve % 1 glukoz ilavesi de T.mentogrophytes ile T.rubrum 'un ayırımında işe yarar.