A gyógyszerhatás fizikai-kémiai alapjai Rozmer Zsuzsanna – Perjési Pál

11.3A permeábilitás jelentősége

A sejtmembránon keresztül végbemenő transzport több tulajdonság együttes hatásának következménye. Ezek közül egyik igen fontos a sejtmembrán lipid-fehérje és lipid-koleszterin aránya, mely arány változtatásával a különböző szövetek modellezhetők.

Passzív transzport szempontjából a vegyületek egyik legfontosabb fizikai-kémiai paramétere a lipofilitás, hiszen a transzportfolyamatok során a zsírsavlánccal kialakuló lipofil-lipofil kölcsönhatás nagyon jelentős. Ugyanakkor figyelembe kell venni a molekulák sav-bázis tulajdonságait is, mely az ionos kölcsönhatás kialakulása miatt is lényeges. Ezeken kívül a vegyületek mérete, alakja, térszerkezete szintén befolyásolja a permeábilitást.

A permeábilitás meghatározása tehát ma már alapvető jelentőségű, hiszen a legjobb prediktora a gyomor-bél traktusból való felszívódásnak, ezáltal az orális biohasznosíthatóságnak.

Az oldhatóságon, valamint a permeábilitáson alapszik az ún. BCS („Biopharmaceutics Classification System”) szerinti osztályozási rendszer. A gyógyszerjelölt vegyületek jó/rossz oldhatóságán és jó/rossz permeábilitásán alapuló besorolás szerint négy csoportot lehet elkülöníteni, amely tehát a felszívódás mértékének megítélésére alkalmas (XI-2. ábra).

XI-. ábra: A BCS osztályozási rendszer.

11.4A permeábilitás meghatározásának kísérletes módszerei

A permeábilitás mérésére az in vivo vizsgálat lenne a legcélravezetőbb, de a kutatás korai fázisában erre nincs lehetőség. Az in vitro körülmények közötti meghatározásra kétféle kísérletes rendszer ismert, a sejtes én nem-sejtes elrendezésű modellek.

11.4.1A PAMPA-modell

A PAMPA („Paralell Artificial Membrane Permeability Assay”) technika mesterséges membránokat (foszfolipideket) használ a penetráció vizsgálatára.

Egy ún. „szendvics” kamra alsó (donor) és felső (akceptor) fázisát 96 lyukú mérőtálcák képezik, amelyeket egy mesterséges membrán (125 μm vastagságú) választ el egymástól (XI-3. ábra).

XI-. ábra: A PAMPA-modell sematikus vázlata.


Az alkalmazott membránok típusa különböző lehet, például dioleil-(foszfatidil-kolin) (DOPC) vagy foszfatidil-etanolamin (PE) stb. valamilyen inert szerves oldószerben (pl. n-dodekánban) felvett oldata, amelyet a mikrofilter lemezen rögzítenek. A modellezni kívánt apikális és bazolaterális oldalnak megfelelő pH-jú pufferolt közeget helyeznek a donor és akceptor oldalakra. Például a vékonybélen keresztüli felszívódás modellezéséhez pH 6,5 donor – pH 7,4 akceptor összeállítás alkalmazható. A mérendő vegyületet DMSO-törzsoldat segítségével adják a rendszerhez. A két lemezt egymásba illesztik és a rendszert inkubálják. Az inkubálás során a vizsgált vegyület a koncentrációgrádiens hatására passzív diffúzióval átjut a donor mérőtálcából a fogadó oldalra. A donor és akceptor oldalon kialakult koncentrációkat megfelelő analitikai módszerekkel (UV „plate-reader” vagy LC/MS) mérik. Az eredmények alapján jellemezni lehet a vizsgált vegyület penetrációs képességét és a penetráció sebességét. Az alkalmazáskor megválasztható – a cél érdekében - az inkubálás hőmérséklete és ideje, a donor és akceptor közegek kémhatása és a membrán összetétele is.

A mérések alapján az egyes vegyületeket az effektív permeábilitás (P_e) értékkel jellemzik:

ahol, A a szűrő felülete (cm²), t az inkubációs idő (s), t_s a membrán szempontjából kvázi stacionárius állapot eléréséhez szükséges idő (s), V_A az akceptor lyukban levő oldat térfogata (cm³), V_D a donor lyukban levő oldat térfogata (cm³), R a lipid-membránban adszorbeálódott hatóanyag hányad (retenciós faktor), C_D^t a donor oldalon mérhető koncentráció t idő elteltével (mol/cm³) és C_D⁰ a donor oldalon mérhető koncentráció a t=0 időpillanatban (mol/cm³).
A PAMPA-rendszereken végzett mérések jól reprodukálhatók, megbízhatóak, viszonylag alacsony költségűek és nagy kapacitásúak, azaz robusztusak. Automatizálhatók, HT módon is kivitelezhetők. A többféle kísérleti paraméter (lipid összetétel, inkubációs idő, pH, koszolvens stb.) széles tartományban való változtathatósága nagy előnyt jelent. A nyert permeábilitási adatok azonban csak a passzív diffúzión alapuló transzportra adnak információt.

11.4.2Sejtes modellek

A sejtes modellek általános jellemzői közé tartozik, hogy lehetőséget biztosítanak a passzív diffúzió mellett az aktív transzport, az efflux és a metabolikus folyamatok tanulmányozására egyaránt. A forgalmoban lévő készülékek segítségével a vizsgált vegyületek permeábilitásást mérhetjük általunk kiválasztott poliészter membránon tenyészetett sejtrétegen akár bazolaterális-apikális, akár apikális-bazolaterális irányban (XI-4. ábra).

XI-. ábra: A sejtes-modell sematikus vázlata.

A Caco-2 heterogén humán epiteliális kolorektális adenokarcinóma sejtek alkalmazássával mért permeábilitási adat, a passzív diffúzió mellett, az aktív transzportmechanizmusokat is figyelembe veszi.

Az MDCK („Madin-Darny Canine Kidney”, Madin-Darby kutya-vese epitélium) sejtvonal is gyakran alkalmazott modell. Kevesebb transzportert tartalmaz, így főként passzív diffúziót modellez. Az MDR1-MDKC (P-gp-t kódoló génnel transzfektált MDKC) sejtvonal érdekessége, hogy az MDR1 génnel történő transzfekció következtében a sejtvonalban fokozott mértékben van jelen az efflux folyamatokban kitüntetett szerephez jutó P-glikoprotein. Ezáltal lehetőség nyílik az efflux mechanizmusok tanulmányozására is.

Sejtes modellek segítségével az ún. látszólagos permeábilitási állandó (P_app) meghatározása lehetséges:

ahol, dC_r/dt a hatóanyag koncentrációjának időbeli változása a bazolaterális oldalon (mol/dm³s), V_r a bazolaterális oldat térfogata (cm³), A a sejtkultúra felülete (cm³) és C₀ az apikális oldalon mérhető kiindulási farmakon koncentráció (mol/cm³).

A sejtes modellek alkalmazása igen időigényes és sok előkészületet igényel. A sejtek folyamatos figyelmet igényelnek. A kísérletek költségvonzata is nagy, továbbá a kísérleti paraméterek vizsgálati tartománya (pl. a rendszer pH-ja csak szűk tartományban változtatható) korlátozott. Mindemellett nagy előnyt jelent, hogy a passzív és aktív transzport folyamatokról együttesen ad információt, valamint a transz- és paracelluláris transzport egyaránt mérhető vele. A sejtes modelleknél is kidolgoztak már nagykapacitású mérési lehetőségeket.