A gyógyszerhatás fizikai-kémiai alapjai Rozmer Zsuzsanna – Perjési Pál

9.5Az oldhatóság meghatározásának kísérletes módszerei

Az oldhatóság meghatározására számos módszer ismert. Különbséget kell tenni abból a szempontból is, hogy kinetikai vagy termodinamikai oldhatóságot meghatározó módszerről van szó.

A gyógyszerkutatás kémiai felfedező („discovery”) szakaszában a gyors szűrésre, a vegyületek rangsorolására van szükség, ilyenkor az oldatóság meghatározására csak tájékoztató jellegű oldhatósági értékeket szolgáltató módszereket alkalmaznak. Ebben a fázisban több tízezer vegyület gyors mérése a cél, vagyis az alkalmazott eljárásokkal szemben a fő követelmény a gyorsaság, a nagy áteresztőképesség („high throughput”, HT). Általában az 50 vegyület/nap teljesítménynél nagyobb kapacitású módszereket tekintik HT eljárásoknak. A felfedező kutatások során a vegyületek kinetikai oldhatóságát határozzák meg, ilyenkor a mintákat előbb DMSO-ban oldják (20-30 mM), majd ennek kis térfogatait adják a vizes tompító oldathoz. Az anyagkiválás első pillanataiban az oldatlan részt eltávolítják, és az így képződött oldat koncentrációját mérik.

A gyógyszerkutatás fejlesztési fázisában („development”) szükség van a termodinamikai (egyensúlyi) oldhatóság meghatározására. A módszerek lényege, hogy a szilárd anyagot közvetlenül a vizes közegben, anyagfelesleg biztosítása mellet, adott hőmérsékleten hosszabb ideig kevertetik, majd ülepítik és a telített oldat koncentrációját alkalmas módon mérik. Lényeges elvárás a módszerekkel szemben, hogy pontosak, reprodukálhatóak legyenek.

Az oldhatóság meghatározására leggyakrabban alkalmazott analitikai módszereket a IX-3. táblázat foglalja össze.

IX- táblázat: Oldhatóság meghatározására használt analitikai módszerek.

Módszer	Oldhatóság típusa	Módszer típusa	Alkalmazott detektor	Méréshatár
Turbidimetriás	kinetikai	HT	UV	5 μg/ml
Nefelometriás	kinetikai	HT	lézer nefelométer	5 μg/ml
Direkt UV (μSOL)	kinetikai/ termodinamikai	HT	UV	0,1 μg/ml
Fázisoldhatóság	termodinamikai	nem HT	gravimetria	mg/ml
Hagyományos rázótölcséres	termodinamikai	nem HT	UV	1 μg/ml
Miniatürizált rázótölcséres	termodinamikai	HT	HPLC-UV vagy LC/MS	1 μg/ml
Generator column	termodinamikai	nem HT	HPLC	0,1 μg/ml
DTT	termodinamikai	nem HT	potenciometria	5 ng/ml
CheqSol	termodinamikai	HT	potenciometria	0,1 μg/ml

9.5.1A kinetikai oldhatóság meghatározási módszerei

A turbidimetriás módszer bevezetése C.A. Lipinski és mtsai nevéhez fűződik. Lényege, hogy a mérés során a mintát DMSO-ban oldják. A törzsoldatból vizes tompítóoldattal hígítási sort készítenek. A méréseket általában rögzített pH-n végzik. Amely koncentrációértéken elérik az oldhatóság értékét, anyagkiválás történik, amit a nem oldódott részecskék miatti zavarosságból eredő fényszóródás jelez, ami abszorbancia emelkedést okoz az UV-detektorban. A mérések automatizált rendszerben mennek végbe, nagyszámú minta rövid időn belül mérhető. Az eljárás hibája, hogy kis vízoldékonyságú minták esetén a módszer nehezen reprodukálható, túl nagy mennyiségben lehet jelen a DMSO (>1% v/v) és hibát jelent a standardizálás hiánya.

Az ún. nefelometriás eljárás során a fényszóródást az oldat és a szilárd részecskék elválasztása után lézer nefelométerrel mérik, majd ebből számítják ki az oldat koncentrációját.

A direkt UV-módszer során a szilárd fázis eltávolítását követően felveszik a visszamaradt tiszta oldat spektrumát. A hígításos módszerrel referencia oldat is készül. Ebben az esetben is adott mennyiségű mintát kell feloldani az adott kémhatású és térfogatú oldószerben, de a minta mennyisége kevesebb, annak érdekében, hogy a csapadékkiválás ne következzen be. A referencia oldat is esetén is felveszik a spektrumot, majd mindkét spektrum esetében a görbe alatti területek aránya képezi a kiértékelés alapját.

A klasszikus rázótölcséres módszer 96-reakcióhelyes mikrolemezes (96-well plate) technológiára való átdolgozása és robotizálása szintén a teljesítmény növeléséhez vezetett. A minták mérése gyors grádienselúciós fordított fázisú HPLC-vel történik. A módszerek kapacitása nagy, alkalmazásukkal a kinetikai oldhatóság határozható meg. Pontosságuk azonban korlátozott, mivel igen kis térfogatok mérése történik, és általában egy pH-n egy mérés történik. További hátrány, hogy a DMSO-ban való oldás következtében a különböző kristályformák és polimorfok oldhatósága közötti különbségek elvesznek.

9.5.2A termodinamikai oldhatóság meghatározási módszerei

A termodinamikai (egyensúlyi) oldhatóság meghatározására szolgáló klasszikus eljárás a telítéses rázótölcséres módszer. A vizsgálat során a mintát, mely általában kristályos formában van, anyagfelesleg mellett oldják pufferoldatban vagy a biológiai közeget reprezentáló oldatban a telítés bekövetkezéséig. A rázótölcsérben vagy üvegedényben levő mintákat termosztált körülmények között hosszabb ideig (min. 24 vagy 48 óra) kevertetik vagy rázatják, amíg létre nem jön az egyensúly a két fázis (szilárd és oldat fázis) között. Az egyensúly beállása után a fázisokat centrifugálással, szűréssel vagy ülepítéssel szétválasztják, majd egy arra alkalmas analitikai módszerrel (pl. spektrofotometria, HPLC) meghatározzák a tiszta, telített oldat koncentrációját. A módszer hátránya nagy munka- illetve időigénye, valamint nagy anyagigénye. További hátránya, hogy egyelőre nem automatizálható, sok hibalehetőséget hordoz (pl. termosztálás, mintavétel pontossága, átkristályosodás lehetősége, aggregátumok, micellák, illetve kolloid oldat képződése) és hogy a mérés általában egy pH-értéken történik. A módszer előnye az egyszerűsége, sok új módszer validálásakor referencia eljárásként használják.

Ma már több olyan módszer is létezik, az ún. módosított plate módszerek („modified-equilibrium microtitre plate methods”), amelyek a klasszikus telítéses rázótölcséres módszert helyezik át automatizált, 96-lyukú lemez technológiára. Cél elsősorban a teljesítmény fokozása és a szükséges anyagmennyiség (minta, oldószer) csökkentése.

Az ún. fázis-oldhatóság elve, hogy növekvő anyagfelesleg függvényében mérik az oldhatóságot. A vizsgálat során egy mérési sorozatot készítenek: azonos térfogatú oldószerrészletekbe mérnek be növekvő mennyiségű vizsgált anyagot. Az oldatokat több napig zárt rendszerben kevertetik, majd az oldatokból mintát vesznek és gravimetriásan határozzák meg azok koncentrációját. A kapott koncentrációértékeket a bemért mintamennyiségek függvényében ábrázolják, a grafikonon a nulla feleslegre extrapolált adat adja meg az egyensúlyi oldhatóságot. A módszer hátránya szintén nagy munka-, idő- és anyagigénye, viszont nagyon pontos adatokat szolgál.

A „generator column” módszer lényege, hogy a vizsgálandó mintát kolonnába töltött üveggyöngyök felületére viszik fel, majd az oszlopon vizet pumpálnak keresztül. A telítési egyensúly gyorsan beáll, a minta és víz közötti nagy érintkezési felület miatt. Az eluálódott folyadék koncentrációját HPLC módszerrel határozzák meg.

A potenciometriás titráláson alapuló módszerek nagy előnye, hogy ionizálható molekulák oldhatóságának meghatározására használhatók. A DTT-módszeren („dissolution template titration”) alapszik az ún. pSOL oldhatóság-meghatározó készülék. A vizsgálat indulásakor meg kell adni a minta pK_a és logP_o/v értékeit, amelyekből a műszer egy elméleti pH - mérőoldat fogyás titrálási görbét hoz létre, amely mintaként szolgál a méréshez. A mérés kezdetén a szilárd anyagot feloldják erős bázisban, illetve savban, majd 10-60 percig kevertetik. Az ionizált formát biztosító pH irányából megindul a titrálás. Detektorként pH-mérő elektród használatos. A mérőoldat adagolás sebessége a titrálás elején gyorsabb, majd a végponthoz közeledve lassul, majd a végpont után újra gyorsul. Azon a pH értéken, ahol a molekula deprotonálódik (bázisok) vagy protonálódik (savak), vagyis nemionizált formába kerül, kicsapódik. A csapadékkiválást torzulást okoz a titrálási görbén, melyből az egyensúlyi koncentráció alkalmas szoftver segítségével kiszámítható. A módszer előnye, hogy egy titrálással meghatározható egy adott vegyület teljes oldhatóság-pH profilja. Széles mérési tartományban használható, nagy pontosságú. A módszer hátránya, hogy egy-egy titrálás az oldhatósági egyensúly beállása érdekében 3-10 órát igényel.

Szintén potenciometriás titrálás elvén működik az ún. „chasing equilibrium method” (CheqSol). A normál titrálást követően, olyan anyagkoncentrációnál is el kell végezni a titrálást, ahol a minta nemionizált formája kiválik. A kiválást az oldatba merülő optikai kábel segítségével UV detektor érzékeli, mely a titrálás leállítását vonja maga után. A méréshez tehát olyan anyagmennyiség biztosítása szükséges, melynél a vegyület az ionizált formájának megfelelő pH-n még teljesen feloldódik, de a semleges formájának pH-ján csapadékként kiválik. A kiválást követően sav illetve bázis kis mennyiségű adagolásával, igen kis pH változásokat előidézve a minta hol oldatba megy, hol újra kiválik (túltelített és telített állapot között változik). Igazolt, hogy nyolc ilyen pont meghatározása elegendő az egyensúly beállásához. Az egyensúly kikényszerítése után az oldhatóság számolható. Egy mérés ideje 60-90 percre rövidül. A módszer egyensúlyi és kinetikai oldhatóság meghatározására egyaránt alkalmas, kis anyagigényű, automatizált és jól reprodukálható. A módszer hátránya, hogy csak ionizálható vegyületek oldhatóságának meghatározására alkalmas.