Yem, Tahıl ve Yağlı tohum matrislerinde lc-ms/ms ile Mikotoksin ve Aflatoksin Kalıntısı miktarlandırma analizi, aplikasyon Çalışması

Gıda Analizlerinde LC-MS/MS Aplikasyonları
Yem, Tahıl ve Yağlı tohum matrislerinde LC-MS/MS ile Mikotoksin ve Aflatoksin Kalıntısı miktarlandırma analizi, aplikasyon Çalışması.

(Varian 320 MS Tandem Gold Triple Quadrupole LC-MS/MS Sistemi Kullanılmıştır.)

İçerik:

Aspergillus, Penicillium, Fusarium ve Alternaria spp. gibi küfler tarafından üretilen ikincil metabolizma ürünleri olan mikotoksinler, doğada 100'ün üzerinde küf türü tarafından üretilebilmektedir. Tarımsal ürünlerde mikotoksin oluşumu, uygun koşullarda ürüne bağlı olmak üzere, hasattan tüketime kadar hemen her aşamada meydana gelebilmektedir.
Mikotoksinlerin gıdalardaki oluşumu ve miktarları azaltılabilmekte ancak, gıdalarda oluştuktan sonra tümüyle uzaklaştırılabilmeleri mümkün olmamaktadır. Dolayısıyla, özellikle tahıllar, kurutulmuş meyveler, fıstık, fındık, badem, ceviz gibi gıdalarda belli sıklıkta ölçülebilir miktarlarda aflatoksin bulunabilir.


Mikotoksinler kanser yapıcı, DNA tahrip edici, anne karnındaki fetüsü etkileyici özelliğe sahiptirler,
Ayrıca özellikle böbrek ve karaciğer gibi organları olumsuz etkilerler,

Özellikle aflatoksinler mısır, buğday, pirinç gibi tahıllarda, antep fıstığı, fındık, toz kırmızı biber, baharatlar, kakao, kahve, etler, süt ve süt ürünleri ve kurutulmuş meyveler (incir, kayısı, üzüm gibi) ile hayvan yemlerinde bulunabilir.

Uzun vadede düşük dozda aflatoksine maruz kalınması çok tehlikeli sonuçlara neden olabilmektedir.
Hayvanlarda yapılan çalışmalarda aflatoksin B1’in tümör oluşumunu tetiklediği belirlenmiştir
Yasal düzenlemeler doğrultusunda kabul edilen sınırlardan daha yüksek değerlerde aflatoksin içeren gıda ve yemlerin tüketilmesine izin verilmemelidir.


HPLC Parametreleri :

Enjeksiyon Hacmi : 20 ul

Analiz Süresi: 12 dakika

Kolon Frını : 25 C

Analitik Kolon: Dikma C18 İnspire, 150*2,1 , 3um

LC Gradient şartları :

Zaman (dk.)	% A	% B	Akış (ml/dk)
00:00	90	10	0.25
01:30	90	10	0.25
09:00	10	90	0.25
09:01	90	10	0.25
12:00	90	10	0.25

MS/MS Parametreleri:

Detector Voltage	+ 1800 V
Needle Positive Voltage	5000V
Needle Negative Voltage	(-)5000V
Spray Shield Voltage Positive	600
Spray Shield Voltage Negative	(-)600V
Spray Chamber Temperature	60 °C
Drying Gas Temperature	350°C
C.I.D Gas Pressure	2.40 mTorr
Nebulising Gas Presuure	50 psi
Drying Gas Pressure	35 psi

Numune Hazırlık Prosedürü:

Seçilmiş toplam 10 adet Mikotoksinler ve Aflatoksinler (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, OTA, FB1, FB2İ DON, ZON, T2) organik solvent yardımı ile tahıl, kurutulmuş gıda, yem ve yağlı tohum matrislerinden ekstrakte edilir. Ekstraksiyon metodu Quechers metodunun modifiye edilmesi ile geliştirilmiştir.

• 
  10 g kurutulmuş gıda numunesi 10 ml R1 ile karıştırılarak homojenize edilir.
  
• 
  Homojenize edilmiş örnekten 10g tartılarak 50 mL’lik santrifüj tüpüne alınır.
  
• 
  100 μl R2 ve 10 ml R3 ilave edilir. 2 dk vorteks karıştırıcıda karıştırılır.
  
• 
  4000 rpm de 5 dakika santrifüj edilir.
  
• 
  Santrifüj sonunda, üstteki çözeltiden pipet ile 8 ml alınıp 15 ml’lik cam tüpe aktarılır ve azot akımı altında yaklaşık 0,5 ml kalana kadar uçurulur.
  
• 
  1 ml R4 ilave edilerek çözülür. Numune enjektöre takılan 0.45 m filtreden süzülerek HPLC flakonuna alınır ve LC-MS/MS sistemine 20 uL enjeksiyon yapılır.
  

Mikotoksinlerin tespiti için kullanılan MRM geçiş değerleri :

Analit	ESI (Polarite)	MW	Capillary	MS (m/z)	MS-MS (m/z)	Parçalama Enerjisi (CE)
Aflatoksin B1 (AFB1)	+	312,3	30	313	285	-22
Aflatoksin B2 (AFB2)	+	314,3	30	315	287	-25
Aflatoksin G1 (AFG1)	+	328,3	30	329	243	-25
Aflatoksin G2 (AFG2)	+	330,3	30	331	245	-30
Okratoksin A (OKR)	+	403,8	30	404	239	-22
Deoxynivalenol (DON)	-	296,3	30	(-) 341	294,8	8
Zearalenone (ZON)	-	318,4	30	(-) 317	174,7	22
Fumonisin B1 (FB1)	+	721,8	30	722,6	334,3	-35
Fumonisin B2 (FB2)	+	705,8	30	706,6	336,3	-40
T-2 Toxin (T2)	+	466,5	30	484,4	305,1	-14

Validasyon Sonuçları :

Analit	Doğrusallık (R^2; 0-100 µg/L)	Geri Kazanım (%)	LOQ (µg/L)	Kesinlik (%RSD; Intraassay):
Aflatoxin B1	0,9993	98,22	0,362	3,1
Aflatoxin B2	0,9994	99,55	0,341	2.2
Aflatoxin G1	0,9983	99,76	0,243	1,7
Aflatoxin G2	0,9975	99,44	0,274	1,1
Ochratoxin A	0,9988	100,63	0,459	1.6
Fumanisin B1	0,9990	91,63	28,04	1,9
Fumanisin B2	0,9992	90,63	25,62	3,1
Deoxynivalenol (DON)	0,9979	100,63	22,06	1.4
Zearalenone (ZON)	0,9985	98,63	8,93	1,9
Toxin (T2)	0,9992	99,57	26,3	2,7

Spike Yapılmış yem numunesinde çoklu Mikotoksin analizine ait Kromatogram Örneği :

(Spike Miktarı : 5 ppb AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 ve OTA, 100 ppb T2, 125 ppb FB1, FB2, DON, 20 ppb ZON , yem numunesi )