Yöntemler
Ocak 2015-Temmuz 2018 arasında laboratuvarımıza gön-
derilen 12 239 dışkı örneği, laboratuvara ulaşır ulaşmaz, önce
serum fizyolojik ve 1:5 oranında sulandırılmış Lugol'ün iyod
solüsyonuyla lam-lamel arası preparat hazırlanarak barsak
protozoonları açısından 40 × objektifle mikroskopta incelen-
miştir. Tüm örnekler, barsak helmintlerinin yumurtaları açı-
sından da, fekal konsantrasyon tüpü kullanılarak çöktürme
yöntemiyle hazırlandıktan sonra, mikroskopta 10× objektifle
değerlendirilmiştir. Laboratuvarımızda incelenen örnekler
için tüm mikroskopik sahalarda tek bir parazit elemanı gö-
rülmesi, Blastocystis spp. de dahil olmak üzere tüm barsak
parazitleri için tanı kriteri olarak kabul edilmiştir.
Direkt ve konsantrasyon yöntemiyle mikroskopik ince-
leme sonucunda morfolojik olarak parazite benzer yapılar
görülen dışkı örneklerine, Cryptosporidium spp., Cyclospora
cayatenensis ve Isospora belli açısından modifiye aside di-
rençli boyama, diğer protozoonlar açısından ise trikrom bo-
yama uygulandıktan sonra 100× objektifle mikroskopta ince-
lenmiştir. Bu örnekler ayrıca Cryptosporidium/Giardia direkt
floresan antikor (DFA) (Crypto/Giardia Cel, Cellabs, Brookva-
le, NSW, Avustralya) ve/veya E. histolytica adezin antijenini
belirlemek için ELISA (E. histolytica II™, TechLab, Blacksburg,
VA, ABD) yöntemleriyle değerlendirilmiştir. DFA yöntemiyle
floresan mikroskopta Cryptosporidium spp. ookistleri ve G.
intestinalis kistlerinin görülmesi tanı kriteridir. ELISA yönte-
minde pozitif kontrol örneğinin absorbans değerinin 0.150 ve
daha üzeri olması, negatif kontrol örneğinin absorbans de-
ğerinin ise 0.150’nin altında olması durumunda test geçerli
kabul edilmiş; hasta örneklerinden absorbans değeri 0.150 ve
üzeri olanlar pozitif olarak değerlendirilmiştir.
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) uygulanacak dışkı ör-
nekleri, inceleme yapılıncaya kadar herhangi bir koruyucu
içermeyen Ependorf tüpleri içerisinde -20°C’de saklanmış-
tır. DNA ekstraksiyonu QIAamp DNA stool mini kit (Qiagen,
Hilden, Almanya) kullanılarak üretici firmanın önerisi doğ-
rultusunda yapılmıştır. Elde edilen DNA örneklerine (10 µl)
Multiplexed Diagnostics Gastrointestinal Parasites (5Plex)
(AusDiagnostics, Mascot, NSW, Avustralya) kiti kullanılarak
RotorGene
®
Q (Qiagen, Hilden, Almanya) cihazında üretici
firmanın önerileri doğrultusunda multipleks “real-time” PCR
yöntemi uygulanmıştır. Bu kitle E. histolytica, G. intestinalis,
Cryptosporidium spp. ve Dientamoeba fragilis DNA’sı sapta-
nabilmektedir. Amplifikasyon koşulları 95°C’de 10 dakika baş-
langıç denatürasyonunun ardından 95°C-10 saniye, 60°C-15
saniye, 72°C-15 saniye olacak şekilde 30 döngü reaksiyon ve
75-95°C’de erime eğrisi analizi şeklinde gerçekleştirilmiştir.
Her testte, kit içerisinde mevcut olan pozitif kontrol örnekleri-
nin pozitif, negatif kontrol örneklerinin negatif sonuç vermesi
halinde test geçerli kabul edilmektedir. Reaksiyon sonunda
pozitif örneklerin uygun amplifikasyon eğrisi vermesi sonu-
cunda pozitif, negatif örneklerin amplifikasyon eğrisi verme-
mesi sonucunda ise negatif olarak değerlendirme yapılmak-
tadır.
Dostları ilə paylaş: |