Strains Mycobacterium tuberculosis

of May 3, 2017.

This information is current as

Macrophages

Evade Apoptosis of Infected Alveolar 

 Strains

Mycobacterium tuberculosis

Virulent 

Joseph Keane, Heinz G. Remold and Hardy Kornfeld

http://www.jimmunol.org/content/164/4/2016

doi: 10.4049/jimmunol.164.4.2016

2000; 164:2016-2020; ;

J Immunol 

References

http://www.jimmunol.org/content/164/4/2016.full#ref-list-1

, 13 of which you can access for free at: 

cites 17 articles

This article 

Subscription

http://jimmunol.org/subscription

 is online at: 

The Journal of Immunology

Information about subscribing to 

Permissions

http://www.aai.org/About/Publications/JI/copyright.html

Submit copyright permission requests at: 

Email Alerts

http://jimmunol.org/alerts

Receive free email-alerts when new articles cite this article. Sign up at: 

Print ISSN: 0022-1767 Online ISSN: 1550-6606. 

Immunologists All rights reserved.

Copyright © 2000 by The American Association of

1451 Rockville Pike, Suite 650, Rockville, MD 20852

The American Association of Immunologists, Inc.,

 is published twice each month by

The Journal of Immunology

 by guest on May 3, 2017

http://www.jimmunol.org/

Downloaded from 

 by guest on May 3, 2017

http://www.jimmunol.org/

Downloaded from 

Virulent Mycobacterium tuberculosis Strains Evade Apoptosis

of Infected Alveolar Macrophages

1

Joseph Keane,

2

* Heinz G. Remold,

†

and Hardy Kornfeld*

Human alveolar macrophages (AM

␾) undergo apoptosis following infection with Mycobacterium tuberculosis in vitro. Apoptosis

of cells infected with intracellular pathogens may benefit the host by eliminating a supportive environment for bacterial growth.

The present study compared AM

␾ apoptosis following infection by M. tuberculosis complex strains of differing virulence and by

Mycobacterium kansasii. Avirulent or attenuated bacilli (M. tuberculosis H37Ra, Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Gue´rin,

and M. kansasii) induced significantly more AM

␾ apoptosis than virulent strains (M. tuberculosis H37Rv, Erdman, M. tuberculosis

clinical isolate BMC 96.1, and M. bovis wild type). Increased apoptosis was not due to greater intracellular bacterial replication

because virulent strains grew more rapidly in AM

␾ than attenuated strains despite causing less apoptosis. These findings suggest

the existence of mycobacterial virulence determinants that modulate the apoptotic response of AM

␾ to intracellular infection and

support the hypothesis that macrophage apoptosis contributes to innate host defense in tuberculosis. The Journal of Immunology,

2000, 164: 2016 –2020.

M

ycobacterium tuberculosis has evolved to survive and

replicate inside macrophage phagosomes. It is postu-

lated that macrophage apoptosis may contribute to host

defense against this intracellular infection, analogous to apoptosis

occurring in virus-infected cells. We previously reported that hu-

man alveolar macrophages (AM

␾)

3

undergo apoptosis in response

to intracellular M. tuberculosis infection by a TNF-

␣-dependent

mechanism (1). The virulent M. tuberculosis strain H37Rv was

found to induce less AM

␾ apoptosis than the isogenic avirulent

strain H37Ra. We subsequently reported that IL-10 stimulation

leads to shedding of soluble TNFR2 (sTNFR2) by AM

␾ and that

sTNFR2 can neutralize TNF bioactivity (2). TNF-

␣ expression is

critical for successful host defense of tuberculosis (3); induction of

IL-10 by M. tuberculosis leading to inhibition of TNF-

␣ might

constitute a novel mechanism to evade host defense by virulent

bacilli

The identification of M. tuberculosis virulence factors is essen-

tial to understanding the pathogenesis of tuberculosis and may re-

veal salient components of host defense. To date, no definitive M.

tuberculosis virulence factors have been reported and few M. tu-

berculosis virulence phenotypes in human cells have been de-

scribed (4 – 8). We compared AM

␾ apoptosis in response to in

vitro infection using a panel of mycobacterial strains of differing

virulence. The results presented in this paper demonstrate that ba-

cillary control of host cell apoptosis is a virulence-associated phe-

notype of M. tuberculosis and suggest that AM

␾ apoptosis con-

tributes to innate immunity in tuberculosis.

Materials and Methods

Alveolar macrophages

AM

␾ were obtained from bronchoalveolar lavage fluid of healthy non-

smoking volunteers using standard techniques, with their informed consent

under a protocol approved by the Institutional Review Board of the Boston

University Medical Center. Lavage fluid was filtered through sterile gauze,

centrifuged (450

ϫ g, 10 min), and the cell pellet was suspended in RPMI

1640 medium (Life Technologies, Gaithersburg, MD) with 10% FCS and

cefotaxime 50

␮g/ml. Cells were plated, and nonadherent cells were re-

moved by washing at 24 h. Differential counts were performed on cyto-

centrifuged preparations using the Leuko Stat Stain Kit (Fisher, Pittsburgh,

PA). Viability of adherent AM

␾ was assessed by trypan blue dye

exclusion.

Mycobacteria

A clinical strain of M. tuberculosis was isolated from an immunocompetent

patient with pulmonary tuberculosis at the Boston Medical Center (desig-

nated BMC 96.1); M. tuberculosis H37Rv, H37Ra, and Erdman, as well as

Mycobacterium bovis wild type, M. bovis bacillus Calmette-Gue´rin (BCG),

and Mycobacterium kansasii were purchased from American Type Culture

Collection (Manassas, VA). Before inoculation of AM

␾, mycobacteria

were dispersed by aspiration through a 25-gauge needle five times, vor-

texed, then sonicated (15 s, 500 W) in a bath sonicator (Laboratory Sup-

plies, Hicksville, NY). After sonication, bacterial suspensions were al-

lowed to stand (10 min) and the upper 500

␮l were removed for use in

experiments. For each experiment, the adequacy of dispersion and the mul-

tiplicity of infection (MOI) were checked by acid-fast stain of infected

AM

␾ at 4 h. Ten high-power fields were counted to provide an equivalent

MOI of 5–10 bacilli per cell for each strain examined.

Analysis of AM

␾ viability

AM

␾ were cultured in two-well chamber slides (Nunc, Naperville, IL) at

400,000 cells per well in 1 ml of medium (37°C, 5% CO

2

). Culture medium

was replenished at 24 h, and at 72 h cells were infected with mycobacteria

at an MOI of 5–10. After 4 h, cultures were washed to remove extracellular

mycobacteria. After 5 days, culture supernatants were removed and AM

␾

viability was determined by staining with calcein and eithidium ho-

modimer as previously described (1). One thousand cells counted by flu-

orescence microscopy on each slide were scored as live (green fluores-

cence) or dead (red fluorescence).

Analysis of infected AM

␾ apoptosis

AM

␾ in 96-well microtiter trays were infected with the different myco-

bacterial strains at a MOI of 5–10. After 5 days, apoptosis was measured

*Pulmonary Center, Boston University School of Medicine, Boston MA 02118; and

†

Department of Medicine, Brigham and Womens’ Hospital and Harvard Medical

School, Boston, MA 02115

Received for publication September 21, 1999. Accepted for publication December

3, 1999.

The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page

charges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordance

with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

1

This work was supported in part by National Heart, Lung, and Blood Institute Grants

HL-03964 and HL-44846 and by American Lung Association Grant RT-013-N.

2

Address correspondence and reprint requests to Dr. Joseph Keane, Pulmonary Cen-

ter, R-3, Boston University School of Medicine, 80 East Concord Street, Boston, MA

02118. E-mail address: [e-mail]

3

Abbreviations used in this paper: AM

␾, alveolar macrophage; BCG, bacillus

Calmette-Gue´rin; sTNFR2, soluble TNFR2; H37Ra, M. tuberculosis H37Ra; H37Rv,

M. tuberculosis H37Rv; MOI, multiplicity of infection; T-100, time to reach a Bactec

growth index of 100.

Copyright © 2000 by The American Association of Immunologists

0022-1767/00/$02.00

 by guest on May 3, 2017

http://www.jimmunol.org/

Downloaded from 

using an Ag-capture ELISA for histone and fragmented DNA (Cell Death

Detection ELISA

PLUS

, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) on

cell lysate according to the manufacturer’s protocol.

Assessment of mycobacterial growth

Bactec analysis of AM

␾ lysates and supernatants after bacillary infection

were performed for each mycobacterial strain as previously described (9).

Briefly, AM

␾ were infected with the different mycobacterial strains for 4 h

or 5 days, then lysed with 0.2% SDS in PBS. SDS was neutralized by

adding FCS. Cell lysate and culture supernatant from triplicate cultures

were pooled and inoculated into duplicate Bactec 12B vials containing

[

14

C]palmitic acid. Vials were incubated for 24 h at 27°C, and

14

CO

2

pro-

duction was determined using a Bactec 460 TB instrument that reports a

growth index in arbitrary units ranging from 0 to 999. Vials were sampled

every 24 h until a reading of 999 was reached. For each experiment, the

time required to reach a growth index of 100 (T-100 value) was deter-

mined. Previous studies demonstrated a linear correlation between the

T-100 and the log number of viable mycobacteria measured by plating and

counting CFU (9). In the present study, mycobacterial growth was assessed

by comparing the T-100 values 5 days after infection of AM

␾ to the initial

T-100 value of the same strain 4 h after infection of AM

␾.

Measurement of TNF-

␣, IL-10, and sTNFR2 release

AM

␾ were incubated in the presence or absence of mycobacteria (MOI,

5–10) in triplicate cultures. Supernatants were harvested at 24 h and 5 days

and passed through a 0.22-

␮m pore-size filter (Gelman Sciences, Ann Ar-

bor, MI). The level of immunoreactive TNF-

␣, IL-10, and sTNFR2 was

determined using commercial ELISA kits (R&D Systems, Minneapolis,

MN) in accordance with the manufacturer’s specifications.

Statistical analysis

Cytotoxicity and apoptosis data were compared by ANOVA, and myco-

bacterial growth data were compared using Student’s t test. All statistical

calculations were performed with InStat software (GraphPad Software, San

Diego, CA).

Results

Differential cytotoxicity of virulent and attenuated mycobacteria

Mycobacterial virulence is defined by the ability to cause progres-

sive infection in immunocompentent humans and to cause pro-

gressive infection and death in animal models (10). We infected

normal human AM

␾ with mycobacteria of differing virulence at an

MOI of 5–10 bound or internalized bacilli per macrophage (deter-

mined by acid-fast staining of washed cells 4 h after infection).

The high virulence strains investigated included M. tuberculosis

BMC 96.1 (a human pulmonary tuberculosis clinical isolate with

minimal passage in vitro), M. tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis

Erdman, and M. bovis wild type. Low virulence strains included in

this analysis were M. tuberculosis H37Ra (an isogenic attenuated

strain of H37Rv), M. bovis BCG (an isogenic avirulent strain of M.

bovis), and M. kansasii. After 5 days in culture, AM

␾ viability was

assessed by staining with ethidium homodimer and calcein. Con-

sistent with our earlier studies that compared only H37Rv and

H37Ra (1), all of the virulent mycobacterial strains caused signif-

icantly less AM

␾ cytotoxicity than the attenuated strains (Fig. 1A).

As an example, BCG induced 43%

Ϯ 7% cell death (mean % dead

cells

Ϯ SEM for eight experiments; p Ͻ 0.001), while infection

with M. bovis wild type was associated with no additional AM

␾

death over uninfected control levels of 3

Ϯ 1%.

AM

␾ apoptosis is more potently induced by attenuated than

virulent mycobacteria

To investigate relative induction of AM

␾ apoptosis by virulent and

attenuated mycobacteria, cultures of infected cells were assayed

using an apoptosis-specific ELISA for cytoplasmic histone-asso-

ciated DNA fragments formed in apoptotic cells. Infection with

virulent M. tuberculosis complex strains consistently resulted in

less AM

␾ apoptosis than infection with attenuated strains (Fig.

1B). Virulent M. tuberculosis BMC 96.1 and H37Rv, as well as

with M. bovis wild type, failed to increase AM

␾ apoptosis above

the baseline value for uninfected cells. In contrast, the attenuated

strains H37Ra, BCG, and M. kansasii all caused a significant in-

crease in AM

␾ apoptosis over control.

FIGURE 1.

Virulent M. tuberculosis complex strains cause less AM

␾ cell death and apoptosis than isogenic avirulent strains or the attenuated strain

M. kansasii. A, AM

␾ were cultured on microscopy chamber slides and infected with each of seven different mycobacterial strains. Uninfected AM␾ were

used as controls. After staining with ethidium homodimer and calcein, slides were examined by epifluorescence microscopy and 1000 cells were scored

as live or dead. Viability is expressed as mean % dead cells

Ϯ SEM for seven experiments. Significant differences (p Ͻ 0.05) are indicated by an asterisk.

B, Apoptosis of infected AM

␾ as measured by histone/fragmented DNA ELISA. AM␾ cultured in microtiter plates were infected with each of seven

different strains of mycobacteria. Uninfected AM

␾ cultured in an identical manner served as controls. After 5 days, the histone and fragmented DNA content

of the cells was assessed by Ag-capture ELISA. Relative apoptosis in these cultures is expressed as the mean OD

Ϯ SEM for three separate experiments.

Significant differences compared with control (p

Ͻ 0.05) are indicated by an asterisk.

2017

The Journal of Immunology

 by guest on May 3, 2017

http://www.jimmunol.org/

Downloaded from 

AM

␾ apoptosis is not due to rapid intracellular mycobacterial

growth

Previous experiments have reported faster intracellular growth

rates by virulent mycobacteria in human monocytes and mono-

cyte-derived macrophages (7, 8, 11). Increased AM

␾ cytotoxicity

and apoptosis after infection by attenuated mycobacterial strains

might reflect more rapid growth and accumulation of intracellular

bacilli that could impair critical host cell functions. To investigate

this possibility, growth in AM

␾ was assessed by Bactec analysis

for each of the seven mycobacterial strains employed in these stud-

ies (Fig. 2). The mycobacterial content in AM

␾ cultures at 4 h (day

0) was compared with that at day 5 for each strain. A T-100 value

(time for the inoculated Bactec vial to reach a growth index of 100)

was determined for each strain and time point. The percent change

in T-100 over time was calculated using the equation, %

⌬T-100 ϭ

(T-100 day 5/T-100 day 0)

ϫ 100. The virulent mycobacterial

stains that caused the least amount of cytotoxicity and apoptosis

demonstrated considerable growth in the AM

␾ over 5 days. In

contrast, the attenuated bacilli declined in numbers over the same

time period. This indicates that increased intracellular bacillary

burden is not responsible for the observed high AM

␾ apoptosis

rates with these strains and suggests that host macrophage apopto-

sis might contribute to mycobacterial growth restriction.

Differential apoptosis induction is not related to secretion of

IL-10 or TNF-

␣ or to shedding of sTNFR2

M. tuberculosis-infected AM

␾ become primed for TNF-␣-medi-

ated cytotoxicity, and infection-induced apoptosis appears to be

primarily due to autocrine or paracrine TNF-

␣ death signals (1).

We previously found that IL-10 down-regulates AM

␾ apoptosis

after M. tuberculosis infection by releasing sTNFR2 that neutral-

izes TNF-

␣ (2). Differences in AM␾ apoptosis following infection

by different mycobacterial strains could reflect differences in the

production of TNF-

␣ or IL-10 and/or differences in the shedding of

sTNFR2 from infected cells. This question was assessed in the

present study by measuring TNF-

␣, IL-10, and sTNFR2 in super-

natants of AM

␾ 24 h and 5 days after infection with each of the

seven mycobacterial strains studied. There were large variations in

the response of AM

␾ from different donors, with no consistent

relationship between the level of TNF-

␣, IL-10, or sTNFR2 and

the virulence of infecting organism (Fig. 3). Similarly, no consis-

tent relationship between cytokine or sTNFR2 levels were found in

the same donor cells when infected with virulent or attenuated

bacilli. The levels of TNF-

␣, IL-10, and sTNFR2 at day 5 were

moderately increased compared with 24 h while the overall pattern

of cytokine expression was similar at both time points (data not

shown). These data do not exclude a role for IL-10 or sTNFR2 in

regulating apoptosis of M. tuberculosis-infected AM

␾, but they

suggest the presence of additional mechanisms acting to modulate

this response.

Discussion

We found a consistent pattern of reduced AM

␾ apoptosis and cy-

totoxicity after infection by virulent M. tuberculosis complex ba-

cilli as compared with attenuated or avirulent isogenic strains and

M. kansasii. Virulent bacilli also consistently demonstrated faster

intracellular growth than the attenuated strains despite their asso-

ciation with enhanced host macrophage viability. We were unable

to establish a consistent relationship between the levels of TNF-

␣,

IL-10, or sTNFR2 and the relative virulence of the infecting or-

ganism or the fate of the infected cells. While differential induction

of these factors may play a role in specific cases, it appears that

other mechanisms may also be involved in the modulation of AM

␾

apoptosis by virulent M. tuberculosis.

AM

␾ are the primary host cell for inhaled M. tuberculosis,

which has adapted to survive and replicate within the phagosome.

Apoptosis can be an effective defense strategy to limit the growth

of intracellular pathogens (12). The importance of this innate de-

fense mechanism is demonstrated by the evolutionary acquisition

of apoptosis-inhibiting genes by many viruses. Our data suggest

that macrophage apoptosis also plays a role in defense against M.

tuberculosis. In vitro infection with M. tuberculosis induces AM

␾

apoptosis in a TNF-

␣-dependant manner (1), and apoptotic mac-

rophages are present in pulmonary granulomas and in bronchoal-

veolar lavage cells from patients with tuberculosis (13, 14).

There are several mechanisms whereby macrophage apoptosis

might act to limit M. tuberculosis replication in the lung. Other

investigators have found that the induction of infected monocyte/

macrophage apoptosis by exogenous factors, but not the induction

of infected cell necrosis, limits mycobacterial growth in vitro and

retains bacilli in apoptotic bodies (15, 16). In addition to depriving

bacilli of an intracellular environment that facilitates growth, there

is evidence that ingestion of bacilli contained in apoptotic cells by

freshly added macrophages results in an augmented microbicidal

effect (9). Our data presented here indicates that evasion of host

AM

␾ apoptosis is a M. tuberculosis virulence-associated pheno-

type. This supports the hypothesis that apoptosis contributes to

innate immunity in tuberculosis.

This is the first study to show phenotypic differences among

different strains of M. tuberculosis in an in vitro assay using human

AM

␾. By studying the behavior of human AM␾ following M.

tuberculosis infection, and by employing clinical mycobacterial

isolates, phenotypes more germane to human tuberculosis may be

FIGURE 2.

Growth or inhibition of different mycobacterial strains after

infection of human AM

␾. Mycobacterial growth was measured using a

Bactec

14

CO

2

sampler. The time to reach a Bactec growth index of 100

(T-100) decreases with increasing numbers of bacilli in any sample and is

linearly correlated with log CFU determined by plating and colony count-

ing (9). In the current study, the T-100 on day 0 reflects the number of

intracellular bacilli initially introduced into the cultured AM

␾, while the

T-100 measured at day 5 reflects the number of intracellular bacilli 5 days

later. The % change in T-100 over 5 days was calculated using the equa-

tion, %

⌬T-100 ϭ (T-100 day 5/T-100 day 0) ϫ 100. A positive value

represents intracellular bacterial growth over this time period, while a neg-

ative value represents a bactericidal effect. One representative of three

different experiments is shown. The difference in growth rates between

attenuated mycobacterial strains and virulent strains was significant (p

Ͻ

0.05) using an unpaired t test. A qualitatively similar result was observed

in three different experiments using AM

␾ from different donors.

2018

MACROPHAGE APOPTOSIS AND M. tuberculosis VIRULENCE

 by guest on May 3, 2017

http://www.jimmunol.org/

Downloaded from 

described. Mycobacterial growth rates in a variety of human cells

have been investigated, and it has been reported that virulent

strains replicate faster than avirulent strains (4 – 8, 11). The basis

for this phenomenon has not been established, but our findings

suggest that differential induction of infected macrophage apopto-

sis may be an important factor. Attenuated bacilli caused more

AM

␾ cytotoxicity than virulent strains in our experiments, yet the

growth of the attenuated strains was restricted. This is consistent

with previous reports that the use of exogenous agents such as

H

2

O

2

to cause apoptosis of mycobacteria-infected macrophages

results in mycobacterial death (15). Our studies are unique in that

apoptosis occurred as a direct result of mycobacterial infection,

better reflecting events occurring naturally in tuberculosis. The ca-

pacity of virulent mycobacteria to modulate AM

␾ apoptosis can

reasonably be related to the preservation of a supportive intracel-

lular environment for bacterial growth. By inhibiting host macro-

phage apoptosis, the mycobacteria also avoid being packaged in

apoptotic bodies that are subject to secondary phagocytosis by

newly recruited mononuclear cells. It is postulated that uptake of

bacilli packaged in this way leads to more effective intracellular

microbicidal processing (9).

TNF-

␣ and IL-10 have central roles in the innate response to M.

tuberculosis infection (3, 17), and we described the influence of

these cytokines on AM

␾ apoptosis after M. tuberculosis infection

(2). We found that TNF-

␣ and IL-10 responses of primary human

AM

␾ to M. tuberculosis infection do not correlate with microbial

virulence, suggesting that additional mechanisms also are involved

in the modulation of infected AM

␾ apoptosis. The identification of

contrasting apoptosis-induction phenotypes by the isogenic pairs

H37Ra and H37Rv, as well as BCG and M. bovis wild type, may

offer a means for identifying the microbial genetic basis for this

difference. Analysis of apoptosis responses by murine macrophage

cell lines suggests that host genetic factors may also contribute to

the regulation of cell fate in tuberculosis (18). While we observed

significant variability in cytokine production by AM

␾ from dif-

ferent human donors, the pattern of apoptosis responses has been

very consistent in our experience.

Acknowledgments

We are grateful to Drs. Jussi Saukkonen, Michael Ieong, and Christine

Reardon for assistance in bronchoscopy and to Beth Shurtleff for technical

assistance.

References

1. Keane, J., M. K. Balcewicz-Sablinska, H. G. Remold, G. L. Chupp, B. B. Meek,

M. J. Fenton, and H. Kornfeld. 1997. Infection by Mycobacterium tuberculosis

promotes human alveolar macrophage apoptosis. Infect. Immun. 65:298.

2. Balcewicz-Sablinska, M., J. Keane, H. Kornfeld, and H. Remold. 1998. Patho-

genic Mycobacterium tuberculosis evades apoptosis of host macrophages by re-

lease of TNF-R2, resulting in inactivation of TNF-

␣. J. Immunol. 161:2636.

3. Flynn J. L., M. M. Goldstein, J. Chan, K. J. Triebold, K. Pfeffer, C. J. Lowenstein,

R. Schreiber, T. W. Mak and B. R. Bloom. 1995. Tumor necrosis factor-

␣ is

required in the protective immune response against Mycobacterium tuberculosis

in mice. Immunity 2:561.

4. Shepard, C. C. 1958. A comparison of the growth of selected mycobacteria in

HeLa, monkey kidney, and human cells in tissue culture. J. Exp. Med. 107:237.

5. Byrd, T. F., G. M. Green, S. E. Foxlston, and C. R. Lyons. 1998. Differential

growth characteristics and Streptomycin suceptability of virulent and avirulent

Mycobacterial tuberculosis strains in a novel fibroblast-mycobacterium micro-

colony assay. Infect. Immun. 66:5132.

6. McDonough, K., and Y. Kress. 1995. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a

virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun.

63:4802.

7. Silver, R., Q. Li, and J. Ellner. 1998. Expression of virulence of Mycobacterium

tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular

growth and induction of tumor necrosis factor

␣ but not with evasion of lym-

phocyte-dependent monocyte effector functions. Infect. Immun. 66:1190.

8. Zhang, M., J. Gong, Y. Lin, and P. Barnes. 1998. Growth of virulent and avirulent

Mycobacterium tuberculosis strains in human macrophages. Infect. Immun. 66:

794.

FIGURE 3.

Induction of TNF-

␣, IL-10, and sTNFR2 following in vitro

infection of human AM

␾ with different M. tuberculosis complex strains

and M. kansasii. Supernatant from cultures of infected cells was harvested

at 24 h. Identical cultures of uninfected cells served as controls. Commer-

cial ELISA kits were used to measure TNF-

␣ (A), sTNFR2 (B), and IL-10

(C). Each symbol represents the values derived from a different AM

␾

donor. Qualitatively similar results were observed in cultures of AM

␾ in-

fected for 5 days (data not shown).

2019

The Journal of Immunology

 by guest on May 3, 2017

http://www.jimmunol.org/

Downloaded from 

9. Fratazzi, C., R. D. Arbeit, C. Carini, and H. G. Remold. 1997. Programmed cell

death of Mycobacterium avium serovar 4-infected human macrophages prevents

the mycobacteria from spreading and induces mycobacterial growth inhibition by

freshly added, uninfected macrophages. J. Immunol. 158:4320.

10. Dunn, P. L., and R. J. North. 1995. Virulence ranking of some Mycobacterium

tuberculosis and Mycobacterium bovis strains according to their ability to mul-

tiply in the lungs, induce lung pathology, and cause mortality in mice. Infect.

Immun. 63:3428.

11. Mackaness, G. B., N. Smith, and A. Q. Wells. 1954. The growth of intracellular

tubercle bacilli in relation to their virulence. Am. Rev. Tuberculosis. 69:479.

12. Vaux, D. L., and A. Strasser. 1996. The molecular biology of apoptosis. Science

93:2239.

13. Placido, R., G. Mancino, A. Amendola, F. Mariani, S. Vendetti, M. Piacentini,

A. Sanduzzi, M. L. Bocchino, M. Zembala, and V. Colizzi. 1997. Apoptosis of

human monocytes/macrophages in Mycobacterium tuberculosis infection.

J. Pathol. 181:31.

14. Klingler, K., K.-M. Tchou-Wong, O. Brandli, C. Aston, R. Kim, and W. N. Rom.

1997. Effects of mycobacteria on regulation of apoptosis in mononuclear phago-

cytes. Infect. Immun. 65:5272.

15. Molloy, A., P. Laochumroonvorapong, and G. Kaplan. 1994. Apoptosis, but not

necrosis, of infected monocytes is coupled with killing of intracellular bacillus

Calmette-Gue´rin. J. Exp. Med. 180:1499.

16. Oddo, M., T. Renno, A. Attinger, T. Bakker, H. MacDonald, and P. Meylan.

1998. Fas ligand-induced apoptosis of infected human macrophages reduces the

viability of intracellular Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 160:5448.

17. Zhang, M., J. Gong, D. V. Iyer, B. E. Jones, R. L. Modlin, and P. F. Barnes. 1994.

T cell cytokine responses in persons with tuberculosis and human immunodefi-

ciency virus infection. J. Clin. Invest. 94:2435.

18. Rojas, M., L. F. Barrera, G. Puzo, and L. F. Garcia. 1997. Differential induction

of apoptosis by virulent Mycobacterium tuberculosis in resistant and susceptible

murine macrophages. J. Immunol. 159:1352.

2020

MACROPHAGE APOPTOSIS AND M. tuberculosis VIRULENCE

 by guest on May 3, 2017

http://www.jimmunol.org/

Downloaded from