World Health Organization ctd/mal/97. 20 Rev. 2 2001 Organisation Mondiale de la Santé distr.: Limited original: english



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World Health Organization 

 

 

CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001 

Organisation Mondiale de la Santé                          

DISTR.: LIMITED 

ORIGINAL:  ENGLISH

 

 

 



 

 

 



 

 

 

 

 

 

IN VITRO MICRO-TEST (MARK III) FOR THE ASSESSMENT 

OF THE RESPONSE OF Plasmodium falciparum TO 

CHLOROQUINE, MEFLOQUINE, QUININE,  

AMODIAQUINE, SULFADOXINE/PYRIMETHAMINE AND 

ARTEMISININ

 

 



 

Instructions for use of the in vitro micro-test kit (Mark III) 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



World Health Organisation 

Division of Control of Tropical Diseases 

 

 


 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

This document is not issued to the general public, and all 



rights are reserved by the World Health Organization 

(WHO). The document may not be reviewed, abstracted, 

quoted, reproduced or translated, in part or in whole, 

without the prior written permission of WHO. No part of 

this document may be stored in a retrieval system or 

transmitted in any form or by any means - electronic, 

mechanical or other - without prior written permission of 

WHO.


 

 

Ce document n



=est pas destiné à être distribué au grand 

public et tous les droits y afférents sont réservés par 

l

=Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Il ne peut être 



commenté, résumé, cité, reproduit ou traduit, partiellement ou 

en totalité, sans une autorisation préalable écrite de l

=OMS. 

Aucune partie ne doit être chargée dans un système de 



recherche documentaire ou diffusée sous quelque forme ou 

par quelque moyen que ce soit - électronique, mécanique, ou 

autre - sans une autorisation préalable écrite de l

=OMS


 

 

The views expressed in documents by named authors are 



solely the responsibility of those authors.

 

 



Les opinions exprimées dans les documents par des auteurs 

cités nommément n

=engagent que lesdits auteurs.

 

 



CTD/MAL/97.20 

Page 3

 

 



1. Content of the Micro-test Kit 

 

1.1 Micro-test kit A (basic kit)        

 

 

 

Quantity 

 

Tissue culture plate, 12 x 8 wells, predosed with: 



12  

Chloroquine:  1 - 64 

pmol per well 

Mefloquine:  2 - 128  pmol per well 

Quinine: 

4 - 256  pmol per well 

Amodiaquine: 0.25 - 16.0  pmol per well 

Artemisinin:  0.15 - 150.0  pmol per well 

Sulfadoxine/pyrimethamine: SDX 10 - 10 000 pmol per well  

 PYR 0.125 - 125.0 pmol per well 

 

NOTE: 12 plates in any combination of 6 types of plates as required 



 

Eppendorf pipette, 50 µl 

Eppendorf pipette tip, sterile 



400 

Stock bottle containing RPMI 1640 LPLF, sterile, 20 ml 

Tube, Falcon, presscap, sterile, 6 ml 



100 

Syringe, sterile, disposable, 5 ml 

40 

Needle, 1



2" x 20 gauge, sterile 

40 


Microscope slide, frosted edge (box of 72 or 50) 

Scalpel holder 



Scalpel blade 

Forceps 


Aluminium foil (roll of 30 m x 30 cm) 

  1 

Capillary tube, heparin-treated, sterile, 100 µl (tube of 20) 



Bulb for capillary tube 

Rack, plastic covered wire 



Label, round (sheet of 77) 

Alcohol swabs 



 60 

Autolet pricker 

  1 

Lancet for autolet 



100 

Platform for autolet 

100 

Glass writing pencil 



Candle, pure paraffin 

Buffer for staining, vial with powder sufficient for 1 litre solution 



Romanowsky stain A, plastic dropping bottle, 60 ml 

Romanowsky stain B, plastic dropping bottle, 60 ml 



Curved staining plate 

Instructions for use of the Mark III micro-test kit 



Document WHO/MAL/83.1000, Rev.1 

Record forms  (as appropriate to plates) 



12 

Photograph of pre- and post-culture parasites (Plasmodium falciparum) 1 

Grease, silicone, for candle jar (tube) 

Gloves, protective, rewashable, size medium/large (5 pairs each), pairs 



10 

CTD/MAL/97.20 

Page 4

 

 



1.2 Micro-test kit B (replenishment)       Quantity 

 

Tissue culture plate, 12 x 8 wells, predosed with: 

 

 

 



 

Chloroquine:  1 - 64 



pmol per well 

Mefloquine:  2 - 128  pmol per well 

Quinine: 

4 - 256  pmol per well 

Amodiaquine: 0.25 - 16.0  pmol per well 

Artemisinin:  0.15 - 150.0  pmol per well 

Sulfadoxine/pyrimethamine: 

SDX  10 - 10000  pmol per well 

 

PYR  0.125 - 125 pmol per well 



 

NOTE:  6 plates in any combination as required 

 

Eppendorf pipette tip, sterile 



200 

Stock bottle containing RPMI 1640 LPLF, sterile, 20 ml 

Tube, Falcon, presscap, sterile, 6 ml 



50 

Syringe, sterile, disposable, 5 ml 

Needle, 1



2" x 20 gauge, sterile 

20 


Microscope slide, frosted edge (box of 72 or 50) 

Scalpel blade 



Label, round (sheet of 77) 

Alcohol swabs 



30 

Lancet for autolet 

50 

Platform for autolet 



50 

Capillary tube, heparin treated, sterile, 100 µl (tube of 20) 

Bulb for capillary tube 



Glass writing pencil 

Candle, pure paraffin 



Buffer for staining, vial with powder sufficient for 1 litre solution 

Romanowsky stain A, plastic dropping bottle, 60 ml 



Romanowsky stain B, plastic dropping bottle, 60 ml 

Instructions for the use of the Mark III micro-test kit 



Document WHO/MAL/83.1000, Rev.1 

Sets of record forms for the Mark III micro-test kit (as appropriate to plates) 



25 

Gloves, protective, rewashable, size medium/large (3 pairs each), pairs 

 

 



2. Important Notes 

 

2.1  The in vitro micro-test provides information on the quantitative drug response of 



P. falciparum  irrespective of the patient

=s immune status.  It is an epidemiological tool for 

assessing baseline sensitivity and for monitoring the drug response of P. falciparum over time 

and place and therefore can provide background information for the development and evaluation 

of drug policies.  Changes in parasite drug sensitivity in vitro can be an indicator of future 

therapeutic failure.  Unlike the in vivo tests, the results of an in vitro test are not disturbed by on-

going malaria transmission.  The in vitro test may be carried out with several drugs  

 


CTD/MAL/97.20 

Page 5

 

simultaneously and is independent of the patient



=s clinical condition.  It also permits the 

monitoring of drug response with compounds for which an in vivo test is not yet available.  In 



vitro tests are not, under normal circumstances, employed for the guidance of individual 

treatment.  In the context of drugs with widely varying absorption (e.g. halofantrine) and in 

conjunction with in vivo tests, they permit the differentiation between true resistance and 

treatment failure due to pharmacokinetic factors. 

 

2.2  Tissue culture plates predosed with halofantrine (range 0.015 - 15.0 pmol per well), 



pyrimethamine (range 0.125 - 125 pmol per well) and pyronaridine (range 0.1 - 6.4 pmol per 

well) are available on request, but not routinely provided as part of test kits A and B.  

 

2.3  There are risks associated with taking human blood for the tests.  Hepatitis B virus, human 



immunodeficiency virus (HIV) and other infectious pathogens can be transmitted by the repeated 

use of lancets, needles and other instruments.  All materials supplied with this micro-test kit to 

handle human blood are disposable.  They should be used once only and great care must be taken 

with its proper disposal after use.  The correct procedures are detailed in document 

WHO/MAL/83.1000, Rev.1, Biosafety in in vivo  and in vitro studies of human malaria, by 

D. Payne. 



 

UNDER NO CIRCUMSTANCES  

SHOULD DISPOSABLE MATERIAL BE RE-USED 

 

2.4  In the selection of material used in the WHO standard (Mark III) in vitro micro-test kits, 



every effort has been made to specify material that has a long shelf-life at normal ambient 

temperatures.  However, the RPMI 1640 LPLF liquid medium and the artemisinin-dosed 



plates (ART) have a limited shelf-life which is considerably reduced when the material is 

stored at normal ambient temperature.  Therefore, these items should always be stored at 

+4

1C (normal refrigerator temperature) and transported at this temperature.  



 

2.5  Additionally and whenever possible, the other pre-dosed plates (CHL, MEF, QNN, HAL, 

AMO, PYR, SDX/PYR, PND) should also be stored at +4

1C. 


 

DO NOT PUT ANY OF THE COMPONENTS OF THE TEST KIT  

IN THE DEEP FREEZER 

 

2.6  The most convenient way of transporting temperature-sensitive material is in a thermos or 



cool box with appropriate quantities of cooling blocks.  If ice is used, it should be sealed in 

waterproof bags. 

 

ALWAYS PROTECT TEST MATERIAL FROM  

DIRECT CONTACT WITH COOLANT 

 

2.7  On receipt of the micro-test kits from the supplier, the recipient should immediately 



separate the components with a limited shelf-life and store them appropriately. 

CTD/MAL/97.20 

Page 6

 

 



3. Layout of Micro-culture Plates 

 

3.1 Chloroquine 

 

 



Well 

 

(1) 



 

(2) 


 

(3) 


 

(4) 


 

(5) 


 

(6) 


 

(7) 


 

(8) 


 

(9) 


 

(10) 


 

(11) 


 

(12) 


 

 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 

pmol/



well

 

 



 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

16 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

32 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

64 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

Well A is the control. 



Wells B - H represent chloroquine concentrations of 0.2; 0.4; 0.8; 1.6; 3.2; 6.4 and 12.8 µmol per l blood.  The 

concentrations are expressed in 

µmol / l blood as the malaria parasite shows selective uptake of chloroquine.

 

 



 

3.2 Mefloquine (MEF) 

 

 

Well 



 

(1) 


 

(2) 


 

(3) 


 

(4) 


 

(5) 


 

(6) 


 

(7) 


 

(8) 


 

(9) 


 

(10) 


 

(11) 


 

(12) 


 

 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 

Pmol/



well

 

 



 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 4 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

16 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

32 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

64 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

128 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

Well A is the control. 



Wells B - H represent mefloquine concentrations of 0.4; 0.8; 1.6; 3.2; 6.4; 12.8 and 25.6 µmol per l blood.  The 

concentrations are expressed in 

µmol / l blood as the malaria parasite shows selective uptake of mefloquine.

 


CTD/MAL/97.20 

Page 7

 

 



3.3 Quinine 

 

 



Well 

 

(1) 



 

(2) 


 

(3) 


 

(4) 


 

(5) 


 

(6) 


 

(7) 


 

(8) 


 

(9) 


 

(10) 


 

(11) 


 

(12) 


 

 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 

pmol/



well

 

 



 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

16 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

32 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

128 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

256 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

Well A is the control. 



Wells B - H represent quinine concentrations of 0.08; 0.16; 0.32; 0.64; 1.28; 2.56 and 5.12 µmol per l blood-medium 

mixture (BMM).  The concentrations are expressed in 

µmol / l BMM as the malaria parasite does not show selective 

uptake of quinine. 

 

 

3.4 Halofantrine 



(available on request) 

 

 



Well 

 

(1) 



 

(2) 


 

(3) 


 

(4) 


 

(5) 


 

(6) 


 

(7) 


 

(8) 


 

(9) 


 

(10) 


 

(11) 


 

(12) 


 

 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 

pmol/



well

 

 



 

0.015 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

0.05 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

0.15 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

.50 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

1.50 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

5.00 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

15.00 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

Well A is the control 



Wells B - H represent halofantrine concentrations of 0.3; 1.0; 3.0; 10.0; 30.0; 100.0 and 300.0 nmol per l BMM. The 

concentrations are expressed in nmol / l BMM since the malaria parasite does not seem to show selective uptake of 

halofantrine.

 

 



 

 


CTD/MAL/97.20 

Page 8

 

 



3.5 Amodiaquine 

 

 



Well 

 

(1) 



 

(2) 


 

(3) 


 

(4) 


 

(5) 


 

(6) 


 

(7) 


 

(8) 


 

(9) 


 

(10) 


 

(11) 


 

(12) 


 

 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 

pmol/



well

 

 



 

0.25 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

0.50 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

1.00 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

2.00 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

4.00 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

8.00 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

16.00 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

Well A is the control. 



Wells B - H represent amodiaquine concentrations of 0.05; 0.1; 0.2; 0.4; 0.8; 1.6 and 3.2 µmol per l blood.  The 

concentrations are expressed in 

µmol / l blood as the malaria parasite shows selective uptake of amodiaquine. 

 

 



3.6 Artemisinin 

 

 



Well 

 

(1) 



 

(2) 


 

(3) 


 

(4) 


 

(5) 


 

(6) 


 

(7) 


 

(8) 


 

(9) 


 

(10) 


 

(11) 


 

(12) 


 

 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 

pmol/



well

 

 



 

0.15 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

0.5 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

1.5 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

5.0 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

15.0 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

50.0 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

150.0 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

Well A is the control. 



Wells B - H represent artemisinin concentrations of 3; 10; 30; 100; 300; 1000 and 3000 nmol per l BMM.  The 

concentrations are expressed in nmol / l BMM as the malaria parasite does not show selective uptake of artemisinin.

 

 


CTD/MAL/97.20 

Page 9

 

 



3.7 Sulfadoxine / pyrimethamine 

 

Ratio 80 : 1.  Dose shown for sulfadoxine. 



 

 

Well 



 

(1) 


 

(2) 


 

(3) 


 

(4) 


 

(5) 


 

(6) 


 

(7) 


 

(8) 


 

(9) 


 

(10) 


 

(11) 


 

(12) 


 

 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 

pmol/



well

 

 



 

10 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

30 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

100 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

300 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

1 000 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

3 000 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

10 000 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

Well A is the control. 



Wells B - H represent sulfadoxine concentrations of 0.2; 0.6; 2.0; 6.0; 20.0; 60.0 and 200.0 µmol per l BMM.  The 

corresponding concentrations of pyrimethamine in wells B - H are 0.0025; 0.0075; 0.025; 0.075; 0.25; 0.75 and 2.50 

µmol per l BMM.  The concentrations are expressed in 

µmol / l BMM as malaria parasites show no selective uptake 

of sulfadoxine and pyrimethamine 

 

 



3.8 Pyrimethamine  

(available on request) 

 

 

Well 



 

(1) 


 

(2) 


 

(3) 


 

(4) 


 

(5) 


 

(6) 


 

(7) 


 

(8) 


 

(9) 


 

(10) 


 

(11) 


 

(12) 


 

 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 

pmol/



well

 

 



 

0.125 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

0.375 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

1.25 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

3.75 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

12.5 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

37.5 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

125 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

Well A is the control. 



Wells B - H represent pyrimethamine concentrations of 2.5; 7.5; 25; 75; 250; 750 and 2500 nmol per l BMM.  The 

concentrations are expressed in nmol / l BMM as the malaria parasite does not show selective uptake of 

pyrimethamine. 

 


CTD/MAL/97.20 

Page 10

 

 



3.9 Pyronaridine 

(available on request) 

 

 

Well 



 

(1) 


 

(2) 


 

(3) 


 

(4) 


 

(5) 


 

(6) 


 

(7) 


 

(8) 


 

(9) 


 

(10) 


 

(11) 


 

(12) 


 

 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 



 

 



 

Pmol/



well

 

 



 

0.1 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

0.2 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

0.4 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

0.8 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

1.6 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

3.2 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

6.4 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

 



 

 

Well A is the control. 



Wells B - H represent pyronaridine concentrations of 2; 4; 8; 16; 32; 64 and 128 nmol per l BMM.  Since it is not yet 

known whether malaria parasites take up pyronaridine selectively, the drug concentrations are provisionally 

expressed in nmol / l BMM.

 

 



 



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