Note de curs


Compuşii cuaternari de amoniu



Yüklə 1,11 Mb.
səhifə8/22
tarix19.02.2017
ölçüsü1,11 Mb.
1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   ...   22

Compuşii cuaternari de amoniu Substanţele surfactante (surfactanţii) au în structura lor două zone, una hidrofilă şi alta hidrofobă. În funcţie de sarcina electrică a grupării hidrofile surfactanţii sunt clasificaţi în cationici, anionici, nonionici şi amfolitici. Dintre aceştia compuşii cationici cuaternari de amoniu au demonstrat proprietăţi dezinfectante şi antiseptice. Primul produs introdus în practică, încă din 1935 a fost clorura de benzalkoniu, utilizat cu bune rezultate atât ca dezinfectant cât şi ca detergent. Din păcate activitatea este influenţată negativ de duritatea apei, prezenţa săpunurilor şi reziduurile anionice. Utilizarea ca antiseptic a clorurii de benzalkoniu a fost însoţită de apariţia unor infecţii nosocomiale, chiar manifestări epidemice. Din acest motiv Centers for Disease Control a recomandat scoaterea din uz ca antiseptic a compuşilor cuaternari de amoniu.

În afara primei generaţii cu reprezentantul ei clorura de benzalkoniu, se mai descriu alte două generaţii: generaţia a doua de compuşi cuaternari de amoniu, obţinută prin asocierea unui compus “etil-benzil-clorură” cu un compus “dimetil-benzil”, ceea ce conferă persistenţa acţiunii dezinfectante şi în prezenţa unei ape extrem de dure. A treia generaţie de compuşi se caracterizează prin prezenţa a două lanţuri identice, cum ar fi dodecil-dimetil clorura de amoniu, introdusă în practică înca din 1965. Această structură permite păstrarea acţiunii germicide atât în prezenţa apei dure cât şi a reziduurilor organice. Aceşti compuşi acţionează prin inactivarea unor enzime producătoare de energie, denaturarea proteinelor din compoziţia peretelui celular şi alterarea membranei celulare. Ei mai pot denatura fosfolipidele din componenţa membranei citoplasmatice, cu apariţia unor disfuncţii majore în transportul membranar şi ieşirea din celulă a unor compuşi esenţiali şi a unor ioni (K+).

Compuşii cuaternari de amoniu sunt utilizaţi în principal pentru dezinfecţia spaţiilor spitaliceşti: pereţi, mobilier, pardoseli: Utilizarea lor este limitată de absenţa efectelor germicide asupra virusurilor hidrofile şi a bacilulului Koch.

Biguanidele Biguanidele introduse în practică sunt clorhexidina, alexidina şi polimerii biguanidici, polihexametilen biguanida.

Clorhexidina este una dintre cele mai utilizate substanţe antimicrobiene, în particular ca antiseptic, dar şi ca dezinfectant. De asemenea sunt preparate produse medicamentoase cu rol antiseptic local care conţin şi clorhexidină. Datorită spectrului larg de acţiune pe bacterii, fungi şi virusuri, a efectului slab iritant la nivelul mucoaselor şi tegumentelor produsul este recomandat şi utilizat pe scară largă. Cu toate acestea efectele sunt influenţate în special de pH şi de prezenţa substanţelor organice. La nivelul bacteriilor clorhexidina acţionează prin lezarea membranei celulare externe (bacteriile gram-negative) sau a peretelui celular (bacterii gram-pozitive), ceea ce are drept urmare moartea celulei. Asupra fungilor produce liza protoplasmei celulare. Clorhexidina nu este activă pe micoplasme şi nici pe sporii de Bacillus spp. dar este activă pe sporii care germinează, inhibând în mare parte dezvoltarea formelor vegetative. Activitatea antivirală a clorhexidinei este variabilă, activitatea ei fiind limitată la virusurile cu înveliş lipidic. Clorhexidina nu are un efect semnifcativ pe fagii bacterieni, cum ar fi cei ai Pseudomonas aeruginosa.

Argintul şi compuşii argintului sunt folosiţi de mult timp şi cu rezultate bune în dezinfecţie şi ca antiseptice, datorită calităţilor germicide ale argintului. Cele mai utilizate sunt: nitratul de argint, acetatul de argint şi sulfadiazina argintului.

Nitratul de argint Mecanismul de acţiune se bazează pe proprietea ionilor de argint de a interacţiona cu grupările tiol (sulfhidril, SH). Are loc o alterare a legaturilor aminoacizilor, mai ales ale cisteinei, ale L-metioninei şi ale compuşilor care conţin legături sulfhidrilice (tiosulfatul de sodiu, bisulfitul de sodiu). Ionul de argint, Ag+ se leagă de hidrogen, pe care-l blochează şi împiedică formarea unor compuşi esenţiali metabolismului celular. De asemenea prezenţa Ag+ induce ieşirea din celulă a ionilor de potasiu, K+. Acţiunea argintului se exprimă la nivelul proteinelor şi enzimelor celulare. Nitratul de argint este utilizat ca antiseptic în profilaxia unor infecţii oculare, în prevenirea infecţiilor şi suprainfecţiilor consecutive arsurilor şi pentru distrugerea verucilor, profilaxia infecţiei gonococice la nou-născut.

Protargolul şi colargolul pot fi utilizate ca antiseptice pentru tegumente şi mucoase în concentraţii de 5-10% cu un efect slab bacteriostatic.



Utilizarea dezinfectantelor şi antisepticelor şi fenomenul de rezistenţă microbiană

Utilizarea produselor antimicrobiene numără printre efectele secundare şi apariţia rezistenţei microbiene. Mecanismele rezistenţei microbiene la dezinfectante sunt diferite pentru bacterii, fungi sau virusuri. Rezistenţa poate fi naturală sau dobândită. Anderson şi colaboratorii au demonstrat în studiul lor că dezinfectantele folosite conform reţetei producătorului distrug în aceeaşi măsură atât enterococii vacomicino-sensibili cât şi enterococii-rezistenţi. Autorii concluzionează că acţiunile de sanitaţie şi dezinfecţie trebuie efectuate după protocoalele cunoscute, nefiind nici o legătură între rezistenţa la antibiotice şi cea la dezinfectante. Intr-un alt studiu Rutala şi colaboratorii demonstrează acelaşi lucru investigând comportamentul unor tulpini de Staphylococcus aureus şi S.epidermidis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella choleraesuis şi Pseudomonas aeruginosa. Alte studii raportează aceleaşi rezultate ca cele mai sus menţionate şi susţin observaţia că fenomenul rezistenţei microbiene la antibiotice nu este corelat cu rezistenţa microbiană la dezinfectante şi antiseptice. Totuşi există şi autori care corelează rezistenţa la meticilină a unor tulpini de stafilococ cu rezistenţa acestora la clorura de benzalconiu. Aplicarea corectă a dezinfectantelor şi antisepticelor contribuie la impiedicarea dezvoltării infecţiilor intraspitaliceşti, şi mai ales a manifestării lor epidemice, chiar in condiţiile implicării în etiologia lor a unor germeni rezistenţi sau multirezistenţi la substanţe terapeutice antimicrobiene.



C. MECANISMELE REZISTENŢEI MICROBIENE LA ANTIBIOTICE

Încă de la primele aplicaţii clinice ale antibioticelor s-au semnalat fenomene de rezistenţă la tratament dar aceste aspecte nu au fost luate în consideraţie decât mult mai târziu, odată cu extinderea îngrijorătoare a acestui fenomen. Antibioticele, una dintre cele mai eficiente clase de medicamente, sunt compuşi chimici organici care în contact cu microorganismele le inhibă acestora creşterea sau le omoară. La început obţinute prin prelucrarea unor produse naturale - secreţiile unor fungi sau bacterii - în momentul de faţă cele mai multe antibiotice sunt obţinute prin sinteză chimică. Pentru a fi eficiente, antibioticele trebuie să-şi exercite activitatea anti-microbiană la concentraţii plasmatice care nu sunt toxice sau însoţite de efecte secundare.

În pofida extinderii tot mai largi a spectrului şi a gamei de antibiotice, bacteriile se află la rândul lor într-o permanentă adaptare la condiţiile mediului în care trăiesc. Printre "eforturile adaptative"ale bacteriilor se numără şi mecanismele prin care acestea dezvoltă rezistenţă la substanţele antimicrobiene şi în special la antibiotice. Rezistenţa microbiană la antibiotice poate fi definită ca abilitatea germenilor patogeni de a supravieţui şi de a se multiplica în prezenţa uneia sau mai multor substanţe antimicrobiene. Germenii rezistenţi sunt sau devin "toleranţi" la antibiotice, sustrăgându-se prin variate modalităţi efectului antibacterian scontat, după administrarea de doze terapeutice, netoxice pentru organism.

Rezistenţa microbiană naturală, de specie, sau dobândită, prin apariţia de mutante rezistente la antibiotice este o noţiune absolută care trebuie deosebită de pseudorezistenţă (falsa rezistenţă), noţiune relativă, întâlnită în practica tratamentelor clinice.

Pseudorezistenţa sau falsa rezistenţă este indusă în principal de utilizarea inadecvată a antibioticelor:

-nu s-au folosit antibioticul sau combinaţia adecvate etiologiei;

-nu s-au realizat concentraţii plasmatice eficiente ale antibioticelor;

-apariţia rezistenţei relative a germenilor patogeni, sensibili in vitro dar insensibili – temporar in vivo: existenţa persisterilor, a germenilor cu metabolism redus, forme L etc.;

Rezistenţa microbiană absolută se manifestă atunci când un microorganism nu este influenţat in vitro de antibiotic sau când in vivo sunt necesare concentraţii de antibiotic care ating niveluri toxice pentru organism.

Fenomenul este pe deplin acceptat şi în mare parte cunoscut.



Rezistenţa microbiană dobândită, ca fenomen adaptativ al speciilor microbiene faţă de mediul extern nefavorabil se realizează prin mecanisme diverse, determinate finalmente de specia microbiană implicată şi de tipul de substanţă antimicrobiană utilizată.

Mecanismele prin care germenii dezvoltă şi transfera altora capacitatea de a rezista la acţiunea substanţelor antimicrobiene sunt variate şi arată marea variabilitate din mediul înconjurător.

Mecanismele majore prin care o bacterie poate deveni rezistentă la antibiotice sunt: inhibiţia enzimatică a antibioticelor; impermeabilitatea membranelor bacteriene; alterarea enzimei-ţintă; alterarea ţintei intracelulare; supraproducţia enzimei-ţintă; metaboliţi care scurtcircuitează etapele iniţiale; pomparea activă în exterior a antibioticelor. Apariţia rezistenţei bacteriene la antibiotice a fost întotdeauna corelată cu utilizarea clinică a acestora fără ca întotdeauna cauzalitatea să poată fi stabilită în mod cert.

Apariţia sistemelor computerizate de supraveghere a rezistenţei la antibiotice ca şi organizarea unei adevărate reţele informaţionale la nivel naţional sau internaţional (OMS, UE) facilitează identificarea rapidă a modalitaţilor de apariţie a rezistenţei la substanţe antimicrobiene.



Tehnicile moleculare încep să fie din ce în ce mai mult utilizate în acest scop, genele purtătoare de informaţii legate de rezistenţa la substanţe antimicrobiene fiind identificate, caracterizate. Se pot urmări prin tehnici moleculare: modul de achiziţie a genelor, transferul informaţiilor genetice, procesul epidemiologic de achiziţie a rezistenţei la antibiotice.

O bacterie iniţial sensibilă la un antibiotic poate deveni rezistentă prin diverse căi:

-poate să-şi modifice una din genele ei astfel încât "ţinta" antibioticului este modificată şi acesta nu-şi mai poate exercita acţiunea antibacteriană;

-o alta modalitate este aceea de a achiziţiona o nouă genă care să inactiveze sau -să împiedice accesul antibioticului intracelular;

-unele gene pot interfera sinteza unor compuşi bacterieni care sunt blocaţi de către antibiotic anulând acţiunea specifică drogului;

-rezistenţa poate să se instaleze şi prin apariţia de mutaţii genetice definitive.
BIBLIOGRAFIE
1. ORDEANU V. « Curs de microbiologie generala si farmaceutica » UMF, FF an II, 2009 (nepublicat)

CURS 4

5. Bacteriofagul – structura, cicluri de evolutie

6. Genetica bacteriana – variabilitatea
5. Bacteriofagul – structura, cicluri de evolutie

I. Bacteriofagul este virusul specific pentru bacterii: “mancator de bacterii”. Este adaptat parazitarii celulelor bacteriene si numai pe acestea le paraziteaza (au specific de specie).

Ex: bacteriofagul T4 (Escherichia coli):

- are o structura morfologica complexa, cu cap si coada.

- lungimea vitala este egala cu 200 nm, adica 1/5 µm.

- este de 5 ori mai mic decat cea mai mica bacterie (nu poate fi vazut la microscopul optic).

Structura morfologica a bacteriofagului:



  1. Capul: contine genomul (informatia genetica), cu un ADN dublu circular, ce este protejat de o CAPSIDA formata din CAPSOMERE; are forma icosaedrica (ca un cristal).

  2. Coada:

    • este formata din proteine si prezinta tub cilindric de 80-100 nm, numit CILINDRU AXIAL, protejat de un manson proteic, cunoscut sub denumirea de teaca cozii. Proteinele, pe langa faptul ca protejeaza aceasta parte a bacteriofagului, au si proprietati contractile (sunt aranjate helicoidal), reducand lungimea la jumatate (40-50 nm).

    • prezinta: un guler in partea proximala a tecii (ce are forma de disc hexagonal), o placa bazala in partea distala a tecii. La capetele placii bazale exista crosete, care sunt unitati proteice cu rol de fixare pe bacterii. Pe langa crosete se afla fibre (filamente proteice) cu diametrul de 2 nm si lungimea de 130 nm, cu care se prinde pentru o siguranta mai mare.

    • functii: de protectie, de atasare de bacterii, de penetrare a genomului viral al bacteriei.

Mecanismul de infectare al bacteriofagului obliga bacteria sa sintetizeze bacteriofagi. Acestia nu contin apa.

Bacteriofagii sunt sensibili la agenti fizici (radiatii UV, X), chimici (formol, cloroform) si pot fi supusi operatiei de dezinfectie. Se multiplica, deci sunt vii. Nu au structura celulara. O specie de bacteriofag infecteaza numai o specie de bacterii. Exista tulpini sensibile la diferite tipuri de bacteriofagi si se numesc LIZOTIPI (analiza = lizotipie, se foloseste bacteriofagul.)



Relatia dintre bacteriofag si bacterie:

Exista doua tipuri de cicluri:



  1. ciclu productiv (litic)

  2. ciclul reductiv (lizogen)

  1. In ciclul litic, bacteriofagul se multiplica in celula gazda. Acesta se realizeaza in etape:

    • Adsorbtia bacteriofagului pe suprafata bacteriei: muramidaza, unica enzima a bacteriofagului, lizeaza mureina din peretele bacterian.

    • Astfel, cilindrul axial poate penetra bacteria, teaca cozii se contracta (datorita ATP-ului si ionilor de Ca2+) si AND-ul viral este “injectat” in interiorul corpului bacterian.

    • Multiplicarea bacteriofagului: dupa patrunderea ADN-ului bacteriofagului, AND-ul bacterian este blocat, primul preluand comanda, multiplicandu-se si formand propriile componente.

    • Maturarea bacteriofagului: componentele aparute in sinteza in celula bacteriei formeaza ansamblul bacteriofagului matur, virulent pentru celula gazda.

    • Eliberarea bacteriofagului: bacteria isi inceteaza metabolismul (moare), elibereaza fagii in mediu, datorita endolinizei.

  2. In ciclul lizogen, fagul patrunde in bacterie, aceasta se apara, secretand o substanta represiva pentru virulenta bacteriofagului si inhiba multiplicarea. Astfel, AND-ul viral nu se preia. Apare o integrare a unei noi gene in cromozomul bacterian. Bacteria se dezvolta normal, dar transmite descendentilor gena. Fagul este, insa, nevirulent, cunoscut drept FAG TEMPERAT sau FAG LATENT.

Prin integrarea materialului genetic al fagului, materialul genetic al bacteriei este modificat, rezultand variabilitatea genetica. Profagul redevine virulent: spontan (in cazul lizei celulei gadza) sau indus.

Raporturi intre celulele bacteriei si bacteriofag:

Celula bacteriana poate fi:



  • Lizosensibila: are receptori pentru bacteriofagi si permite multiplicarea lui, rezultand lizarea bacteriei.

  • Lizogena: poarta bacteriofagul sub forma de profag in interiorul ei, il transmite descendentilor si sintetizeaza exotoxine.

  • Lizorezistenta: nu are receptori pentru bacteriofagi (nu se pot fixa pe ea) si rezista atacului bacteriofagului.

Bacteriile lizogene pot deveni lizorezistente, pentru a nu mai fi atacate de alti bacterifagi de acelasi fel (omologi).

Proprietatile bacteriei lizogene:



  • Rezistenta specifica, cunoscuta drept imunitatea bacteriei. Bacteria lizogena este o bacterie lizorezistenta (ex: variola, tetanus – au o rezistenta lunga, spre deosebire de holera, care are o rezistenta scurta).

  • Inductibilitatea: sunt produsi fagi maturi, virulenti: dupa actiunea agentilor inductori (radiatii UV, temperature mai mari de 40º C, agenti chimici, antibiotice) sau spontan.

  • Agentii blocheaza substantele bacteriene represoare, fagul redevenind virulent.

  • Fagul devine defectiv, nu se mai activeaza.

  • Fagul devine recombinant genetic.

Aplicatii practice ale bacteriofagiei:

  • Bacteriofagii sunt indicatori ai gradului de poluare al apelor (cu materii fecale, care contin agenti patogeni eliminate de bolnavi). Se determina existenta E. coli prin prezenta bacteriofagilor (metode indirecte)

  • Lizotipia, prin determinarea sensibilitatii bacteriilor la bacteriofagi.

  • Determinarea focarelor de infectie, traseul bolii, evolutia si studiilor epidermologice.

  • In studiile de oncogenitate virala.

  • In studiul ariabilitatii genetice a bacteriilor.


6. Genetica bacteriana – variabilitatea

Totalitatea determinantilor genei bacteriene reprezinta genomul bacterian. Acesta este organizat astfel: material genetic nuclear organizat in cromozomi, unic in celula procariota si material genetic extracromozomial, organizat in plasmide, ce se gasesc in citoplasma (factori de sex [E], de rezistenta [R], colicinogenic [col]). Genomul asigura ereditatea bacteriei, avand capacitatea de a transmite descendentilor caracterele de specie. Totalitatea acestor caractere reprezinta informatia genetica, adica genotipul. Caracterele exprimate formeaza fenotipul.



Materialul genetic bacterian:

Cromozomul de ADN este dublu catenar, helicoidal si detine informatia pentru functiile vitale ale celulei bacteriene. Exista un singur cromozom si un singur lant de ADN. Crmozomiul nu are membrane celulara, e in contact direct cu citoplasma si are lungimea de 1 nm, atunci cand corpul bacteriei are 1-2 μm.

Componentele cromozomului:


  • Gena, ce codifica informatia pentru proteine.

  • Cistonul, ce codifica informatia pentru polipeptid.

  • Codonul reprezinta unitatea morfologica, formata din 3 baze azotate succesiva. Acestea sunt in numar de patru, ce se grupeaza cate trei: baze purinice: adenina (A), guanina (G) si baze pirimidinice: citozina (C), timina (T). ARN-ul are aceleasi baze azotate, cu exceptia timinei, care este inlocuita cu uracilul (U).

In matrita de ADN, prin intermediul ARN polimerazei, se sintetizeaza ARN mesager, care va fi decodificat in ribozomi si se vor sintetiza proteinele.

Materialul genetic extracromozomial stocheaza informatiile genetice neesentiale, contribuie la variabilitatea bacteriana si sunt alcatuite din ADN dublu catenar, helicoidal, precum plasmidele (2 feluri: propriu-zise si episonii) si elementele transpozabile (secvente de insertie si transpozomi).



Plamidele propriu-zise sunt formatiuni circulare, ce nu integreaza cromozomii si sunt de sine statatoare. Factorul R are una sau mai multe gene care codifica rezistenta fata de unul sau mai multe antibiotice (chimio-terapice). Factorul de transfer al R – gena RFT – codifica sinteza unui canal de propriu de conjugare si se multiplica independent de ritmul de multiplicare al cromozomului. Exista factori COL, ce contine diferite informatii pentru sinteza unui factor F, aparandu-se de celelalte bacterii. Factorul F este independent in citoplasma, bacteriofagul fiind inserat in citoplasma.

Episomii contin ADN dublucatenar, helicoidal, circular. Sunt autonomi in citoplasma si integrati in cromozomii bacteriei. Inelul cromozomului se rupe, se integreaza episonul, apoi inelul se refacesi informatia genetica este transmisa descendentilor.

Exista secvente de insertie ce sunt, de fapt, secvente scurte de ADN,ce nu detin informatia genetica suficienta pentru a codifica o proteina, dar care modifica informatia genetica, determinand un alt fenotip, lipite pe o alta structura si transpozomi (secvente de ADN liniar), ce detin informatia pentru sinteza unei proteine pentru rezistenta fata de antibiotice. Nu se multiplica, se replica o data cu cromozomul, pe care se insera.



Variabilitatea genetica la bacterii

Bacteriile se replica semiconservativ, existand aparate de modificare genotipice la celulele fiice.



Ereditatea reprezinta pastrarea caracterelor de specie, prin replicarea ADN-ului cromozomial.

Variabilitatea reprezinta aparitia modificarilor fenotipice la celulele fiice si pot fi definitive sau de scurta durata. Variabilitatea consta in variatii fenotipice, adaptative, de scurta durata, ce nu se transmit descendentilor (apar sub influenta conditiilor de mediu) si genetice (modificari definitive la nivelul materialului genetic, ce se transmite descendentilor prin replicare).

Apar modificari la nivelul materialului genetic, prin mecanismele de mutatii genetice si transfer si recombinare genetica.



Mutatiile genetice apar in cursul diviziunii exponentiale a bacteriei, dat de ritmul de crestere. Modificarile au loc la nivelul bazelor azotate, astfel genomul celulei fiice nu este la fel cu cel al celulei mama. Cel ce sufera mutatia se numeste mutant. Mutatiile apar prin: inlocuirea bazelor purinice sau pirimidinice cu o alta molecula, insertia unei baze noi, prin deletia, insertia sau inversarea ordinii bazelor.

In functie de numarul bazelor afectate, exista mutatii punctiforme sau extinse, spontane (greseli de copiere la replicare, datorita vitezei crescute) si induse (datorate factorilor inductori, ce determina modificari ale baelor sub influenta factorilor fizici, chimici, biologici).



Transferul si recombinarea genetica au loc intre celule donatoare si celule receptoare. Transferal se realizeaza in cadrul aceleiasi specii, intre specii diferite si se transmit fragmente de genom sau genom intreg. Mecanismul are la baza trei fenomene: transformarea, transductia si conjugarea.

Transformarea: celulele receptoare preiau molecula de ADN , iar celula donoare intra intr-o faza de inmultire exponentiala (stare de competenta). ADN-ul trece prin perete, membrane, se prinde de cromozomii celulei primitoare, se recombine genetic prin fenomenul de “crossing-over”.

Transductia: se castiga material genetic cu ajutorul bacteriofagilor, ce cara material genetic de la o bacterie la alta (dupa integrarea bacteriofagului in genomul bacteriei, rezulta profagul care, redevenind virulent in anumite conditii, se desprinde din genom, antrenand gene proprii ale bacteriei). Fagul este transductor, iar bacteriile parazitate – transductanti. Exista transductie specializata, generalizata si abortive (cand celula bacteriei este lizata). Conversia lizogenica este transductia care consta in modificarea genomului bacterian doar prin insertie de bacteriofag. O bacterie nepatogena poate deveni patogena prin castigarea capacitatii de sinteza de exotoxine, dupa inserarea bacteriofagului. Bacteriile lizogene manifesta noul caracter (toxinogeneza) atat cat sunt parazitate de profag.

Conjugarea: reprezinta transferul de material genetic de la donor la acceptor, prin canale de conjugare (femel-mascul). Celulele donoare poseda factor F, care trece prin canal in citoplasma. Conjugarea are rol in castigarea de rezistenta la antibiotice (factorul R).

BIBLIOGRAFIE


7. ORDEANU V. « Curs de microbiologie generala si farmaceutica » UMF, FF an II, 2009 (nepublicat)


Yüklə 1,11 Mb.

Dostları ilə paylaş:
1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   ...   22




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©www.azkurs.org 2020
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə