Laboratuvar kilavuzu



Yüklə 144.33 Kb.
tarix03.04.2017
ölçüsü144.33 Kb.

Erzurum Teknik Üniversitesi

Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü



HÜCRE BİYOLOJİSİ

LABORATUVAR

KILAVUZU

http://www.mpbio.com/images/landingpages/8_4f6dbc303552df3f6f67aac9e883be21b7802d77_2932.jpg

Arş.Gör.Özlem ÖZDEMİR




İÇİNDEKİLER

Lab 1 ………………. Bakteri Büyüme Eğrisi

Lab 2 ………………. Hücre Sayımı ve Canlılık

Lab 3 ………………. Kloroplast İzolasyonu

Lab 4 ………………. Klorofil Miktar Tayini

Lab 5 ………………. Fotosentez – Hill Reaksiyonu

Lab 6 ………………. Kan Hücrelerinin Fraksiyonlanması

Lab 7 ………………. Hücre Kültürü I

Lab 8 ………………. Hücre Kültürü II - MTT Testi

Lab 9 ……………… İmmunohistokimya

LABORATUVAR 1



BAKTERİ BÜYÜME EĞRİSİ

1.1. GİRİŞ

Organizmanın gelişimi sırasında hücre boyutunda ve kütlesindeki artış büyüme olarak tanımlanır. Organizmalar kendi hücresel biyosentezleri ve enerji generasyonu için bazı temel parametrelere gereksinim duyarlar. Hücrenin büyümesi fiziksel faktörlerden besinlerden etkilenmektedir. Fiziksel faktörler pH, sıcaklık, osmotik basınç, hidrostatik basınç, organizmanın büyüdüğü ortamın nemi vb. besinsel faktörler ise büyüme ortamı için gerekli olan karbon, nitrojen, sülfür, fosfor ve diğer eser elementlerden oluşur. Bakteriler tek hücreli organizmalardır. Belli bir boyuta ulaşan bakteri binary fizyon(bölünme) ile bölünmeye başlar. Binary fizyonda bir hücre ikiye, iki hücre dörde bölünerek geometrik artış ile bölünme devam eder.

c:\users\pc1\desktop\stage-3.jpg

Şekil4.1. Binary fizyon

(http://www.microbiologyonline.org.uk/about-microbiology/introducing-microbes/bacteria)

Bakteriyal büyüme popülasyonu çalışmak için canlı bakteri hücreleri steril besiyerine ekilmeli ve optimum büyüme koşullarında inkübe edilmelidir. Bakteri besiyerindeki içeriği kullanmaya başlar ve kütle ve boyutunda artış gösterir. Bakteriyal büyüme zaman - inkübasyon süresi ya da zaman- hücre sayısı (log) hücre büyüme eğrisi çizilerek belirlenir.bu eğri s biçiminde bir eğridir ve standart büyüme eğrisi olarak bilinir.

Organizmanın hücre kütlesindeki artış spektrofotometre kullanılarak ölçülür. Spektrofotometre optik densite veya yoğunluğu (bakteriyal süspansiyon tarafından absorbe edilen ışık) ölçer. Besiyerindeki yoğunluğun derecesi direk olarak mikroorganizma sayısı( ölü veya canlı ) ile ilişkilidir.

Bu yöntem organizmanın büyüme oranını hesaplamada kullanılan hızlı ve pratik bir yöntemdir. Besiyerindeki yoğunluk artışı hücre kütlesindeki artışı göstermektedir. Besiyeri yoluyla iletilen ışığın miktarı absorbans değerindeki artış ile düşmektedir.

c:\users\pc1\desktop\bacterial gro(1).png

Şekil 4.2. Bakteriyal süspansiyon absorbans

(http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=1105&cnt=1)

Büyüme eğrisi 4 farklı fazdan oluşmaktadır.

1.    Lag Faz
Bir organizma yeni besiyerine konulduğu zaman, organizmanın bu yeni çevreye adapte olması biraz zaman alır. Bu faz lag faz olarak adlandırılır.bu fazda hücre metabolizması hızlanır, hücre boyutunda artış gözlenir fakat bakteri replike olmak için henüz hazır değildir bu yüzden de hücre kütlesinde artış gözlenmez. Lag fazın uzunluğu organizmanın daha önceki durumuyla doğrudan ilişkilidir. Zengin br besi yerinden besin içeriği az olan bir ortama inokule edildiğinde organizmanın yeni ortama adapte olması daha fazla zaman gerektirecektir. Organizma büyümesi için gerekli proteinlerin,co-enzimlerin ve vitaminlerin sentezine başlayacak dolayısıyla lag fazında artış gözlenecektir. Aynı şekilde besin içeriği az olan ortamdan zengin bir besiyerine alınan organizma bu çevreye daha kolay adapte olacak ve gecikme olmadan hücre bölünmesi başlayacak ve lag faz kısalacak belki de hiç olmayacaktır.
2.    Eksponensiyal yada Logaritmik(Log) Faz

Log fazda mikroorganizmalar hızlı bir büyüme ve bölünme evresindedir.metabolik aktiviteleri artar ve organizma binary fizyon ile DNA replikasyonuna başlar. Besiyeri maksimum oranda kullanılır, kültür maksimum büyüme oranına ulaşır ve bakteri sayısı logaritmik olarak artar ve tek bir hücre bölünerek iki hücre oluşturur ve bölünme devam ederek 4, 16,32,… şeklinde artış gösterir. ( 20 , 21 , 22 ,23 ……….. 2n n: generasyon sayısı)

Bakterinin sayısını ikiye katlamak için geçen bu süreye generasyon süresi denir. Generasyon süresi organizmalar arasında farklılık gösterir. ÖrneğinE.coli  20 dakikada bir bölünür yani generasyon süresi 20 dakikadır. Staphylococcus aureus  için ise 30 dakikadır.

3.    Durağan Faz

Bakteriyal popülasyon büyümeye devam ederken besiyerindeki bütün besinler organizma tarafından kullanılır. Bunun sonucunda ise atık maddeler, toksik metabolitler ve inhibitörler birikmeye başlar. Bu durum besiyerinin pH ve sıcaklık gibi özelliklerini değiştirir ve bakteri büyümesi için uygun olmayan ortam oluşur. Çoğalma oranı azalacak, bölünen hücre sayısı ile ölen hücre sayısı eşitlenecek ve son olarak bakteri bölünmesi tamamen duracaktır.

Hücre sayısı artmyacak ve büyüme oranı sabit kalacaktır. Eğer bir hücre durağan fazdan alınıp yeni bir besiyerine konulursa hücre kolaylıkla eksponensiyal faza geçecektir ve normal metabolik aktivie gösterecektir.

4.    Ölüm Fazı

Besinlerin tüketilmesi ve metabolik atık ürünlerin ve diğer toksik materyallerin fazla miktarda birikmesi bakterinin ölüm fazına girmesine neden olacaktır. Bu fazda bakteri çoğalma özelliğini kaybeder ve her bir bakteri olumsuz koşullardan dolayı ölmeye başlar. Ölen hücre sayısı canlı hücre sayısından fazla olur. Bazı organizmalar bu olumsuz koşullara direnir ve endospor oluşturarak hayatta kalır.





Log fazı

Hücre sayısı (log)

Lag fazı

Ölüm fazı

Durağan faz
http://amrita.vlab.co.in/userfiles/1/image/bacterial%20graph.jpg

Şekil 1.3. Bakteri büyümesindeki farklı fazlar

BÜYÜME ORANI VE GENERASYON SÜRESİ



Daha önce de bahsedildiği gibi log fazında bakteri büyüme oranı bakterinin generasyon süresini belirlemede kullanılmaktadır. Generasyon süresi Bakteriler arasında farklılık göstermektedir.

Tablo 1.1. Bazı bakterilerin generasyon süreleri

Bakteri

Besiyeri

Generasyon süresi(dakika)

Escherichia coli

Glucose-salts

17

Bacillus  megaterium

Sucrose-salts

25

Streptococcus lactis

Milk

26

Streptococcus lactis

Lactose broth

48

Staphylococcus aureus

Heart infusion broth

27-30

Lactobacillus acidophilus

Milk

66-87

Rhizobium japonicum

Mannitol-salts-yeast extract

344-461

Mycobacterium tuberculosis

Synthetic

792-932

Treponema pallidum

Rabbit testes

1980

Generasyon süresinin hesaplanması:


g= generasyon süresi

t = zaman aralığı ( saat veya dakika)

n= generasyon sayısı
Bakteriler binary fizyon ile katlanarak bölünürken bakteri popülasyonunda da artış gözlenir. Bir hücre ile başladığımızı düşünürsek ilk generasyonda 2 hücre oluşacak, ikinci generasyonda 4 hücre, üçüncü generasyonda 8 hücre oluşacaktır.

n= t/g

g = t x log2 / [ log ODson –log ODilk]


b= zaman aralığının sonundaki bakteri sayısı

B= zaman aralığının başlangıcındaki bakteri sayısı


b = B x 2n

1.2. MATERYALLER VE METOT

Materyaller :

Besiyeri

Steril flask

Küvet


Bakteri kültürü

Spektrofotometre



Metot:

  1. Bakteri kültürü 15 ml besiyerine inokule edilir ve overnight saklanır.

  2. Ertesi gün bu kültürün spektrofotometrede OD’si ölçülür. OD her 30 dakikada bir kontrol edilerek kaydedilir.

  3. OD değerleri kullanılarak organizmanın standart büyüme eğrisi çizilir.( absorbans – zaman grafiği )

  4. Generasyon süresi hesaplanır.

LABORATUVAR 2



HÜCRE SAYIMI VE CANLILIK

2.1. GİRİŞ

Hücre sayımı hemositometre adı verilen özel lamlar kullanılarak yapılır. Hemositometre üzerinde mikroskobik boyutta kareleri bulunan özel bir lamdır.

Sayım yapılacak örnek uygun oranlarda seyreltilirek hemositometre lamına yüklenir ve mikroskopta manuel olarak sayılır. Bu yöntem ile kan içerisinde bulunan şekilli elemanlar sayılabileceği gibi spor, bakteri, partikül, sperm ve semen gibi mikroskobik boyuttaki tüm elemanların sayımını yapmak mümkündür.

Hemositometre özel bir lamdır ve birçok tipi bulunmaktadır(Thoma, Neaubauer vb gibi) Tümünde temel prensip aynı olmakla beraber ufak bazı farklılıklar bulunmaktadır.

Neubauer hemositometresi üzerinde iki sayım alanı bulunur. Bu iki sayım alanı bir çukurluk ile birbirlerinden ayrılmıştır. Her bir sayım alanında köşelerde dört tane 1 mm2'lik bölümler (büyük kareler) bulunur. Bunlar 16 tane orta büyüklükte kareye ayrılmıştır (1/4 X 1/4 = 1/16 mm2). Ortada bulunan büyük kare ise 25 tane orta büyüklükte kareye ayrılmıştır. Orta büyüklükteki karelerin etrafı çift cizgi ile çevrilmiştir. Her bir orta kare de 16 küçük kareye bölünmüştür. Böylece, ortadaki alanda 25 tane orta kare, 400 tane küçük kare vardır. Bir küçük karenin alanı 1/20 X 1/20 = 1/400 mm2'dir. Sayım alanı dışında kalan kenarlar, sayım alanı yüzeyinden 1/10 mm yüksektir. Sayım alanı üzerine hemositometrenin lameli konulunca, lamel ile sayım alanı yüzeyi arasında 1/10 mm'lik bir boşluk kalır. Böylece lam ve lamel arasında kalan her karenin hacmi hesaplanabilir: En büyük (1mm2'lik) karenin hacmi, 1 X 1 X 1/10= 1/10 mm3 olurken, en küçük (1/400 mm2'lik) karenin hacmi; 1/20 X 1/20 X 1/10= 1/4000 mm3 olmaktadır.

http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/countgrid.gif

Şekil 2.1. Neaubauer lamı

Not: Kullanımdan hemen sonra sayım odacıkları ve lameller ılık su ile durulanmalı, temiz, tüy bırakmayan bezle kurulanmalı ve hava ile temas ederek kurumaya bırakılmalıdır. Yüzeylere gazlı bez veya keten bez değdirilmemelidir çünkü bu materyaller belirli ölçülerde çizilmiş alanları çizebilir.



2.2. MATERYAL VE METOT

Materyaller

Neubauer lamı

Lancet

Distile su



Mikroskop

Metot

  1. Lancet yardımıyla parmaktan alınan kan 1:20 oranında dilüsyon için sulandırılır.

  2. Hemositometrenin odacığına pipetle yüklenir Kapiller hareketle odacığın dolması beklenir. Kuyucuk fazla doldurulmamalıdır. Sayım alanları ayrı ayrı, pipetin ucu lam ile lamelin birleştiği kenara dokundurularak sayım sıvısı ile doldurulur (sıvı, lamelin altını kaplamalı, fakat lamelin kenarlarından taşmamalı ve iki sayım alanı arasındaki boşluğa girmemelidir). Odacığa lamelin altındaki boşluk dolacak kadar sıvı koyulmalıdır. Hemositometrenin lameli, sayma lamındaki sayım alanlarının üzerine konulur.0

  3. Hücrelerin sayım alanı üzerine yerleşmeleri için 4 dakika beklenir ve homojen hücre dağılımı açısından odacık küçük büyütme objektifi ile kontrol edilir.

  4. Eritrositler, Neubauer lamının ortasında bulunan 25 karede sayılır.

  5. Eritrosit Sayım Sonucunun Hesaplanması:

1 mm3 kandaki eritrosit sayısını bulmak için hacim ve sulandırma(dilüsyon) katsayısını hesaplamak gerekir

Hacim katsayısı: 5 büyük karedeki (80 küçük kare) eritrosit sayımı yapıldığı için 5 büyük karenin hacmi hesaplanır.

V= a2 .h V=0,2 x 0,2 x0,1 V=0,004 mm3

1 büyük karenin hacmi 0,004 mm3 ’tür. 5 büyük karenin hacmi ise 0,004 x5=0,02 mm3 ’tür.1 mm3’ deki eritrosit sayısını bulmak için : 0,02. X = 1 X= 1: 0,02 X= 50 (Hacim katsayısı)

80 küçük karenin hacmi 0.02 mm3 tür. Bir mm3 için sayı 50 ile sonra kan 200 defa dilüe edildiğinden 200 ile çarpılır.

1 mm3 kandaki eritrosit sayısı = Sayılan eritrosit sayısı x hacim katsayısı x sulandırma katsayısı

LABORATUVAR 3

KLOROPLAST İZOLASYONU

3.1. GİRİŞ

Normal bir hücre çeşitli organel ve moleküller içerir. Dolayısıyla özgün bir bileşenin fonksiyonunu veya özelliklerini çalışmak için öncelikle saflaştırma yapılmalıdır. İlk yapılacak adım ise genellikle lizis veya parçalama ile istenen organel veya molekülü bozulmadan elde etmektir. Parçalama işlemi mekanik , kimyasal ya da çeşitli biyolojik ajanlar kullanılarak yapılabilir. Kullanılacak yöntem seçiminde bir dizi denemeden sonra en iyi sonucu veren yöntem seçilir.

Hücre parçalanması uygun osmotik kuvvet ve pH'a sahip tampon varlığında gerçekleştirilir. Tampon içerisinde sıklıkla proteaz inhibitörleri bulunur ve tüm prosedür hücre bileşenlerinin degradasyonunu yavaşlatmak / engellemek için soğukta (+4 °C) gerçekleştirilir.

Ayrıca kloroplast izolasyonu klorofil yıkımını (photo-destruction) en aza indirgemek amacıyla loş ışıkta gerçekleştirilir.


Kloroplast izolasyon metodunda, hücre duvarı blender veya homojenizatör yardımıyla mekanik olarak parçalanır. Daha sonra parçalanmamış yaprak dokuları ve hücresel debris filtrasyon ile uzaklaştırılır. Kloroplastlar ise santrifüj ile toplanır. Santrifüjden sonra parçalanmış ve parçalanmamış kloroplastlar elde edilir. Parçalanmış kloroplastlar uzaklaştırılır ve sağlam olan kloroplastlar sonraki çalışmalar için saklanır. İzole edilen kloroplastlardan klorofil molekülünün konsantrasyonu belirlenebilir. Ayrıca kloroplastlardan DNA ve RNA izolasyonu da yapılabilir.

3.2. MATERYAL VE METOT:

Materyaller:

Taze ıspanak yaprakları

Bıçak ve makas

Soğutulmuş havan

Tülbent

Kloroplast izolasyon tamponu

Santrifüj

Spektrofotometre

Kloroplast izolasyon tamponu:

0.3 M Sorbitol

0.1 M Tris-Cl, pH 7.8

5 mM MgCl2

10 mM NaCl

Metot:

  1. 4 g taze ıspanak (Spinacia oleracea) tartılır.

  2. Ispanak yapraklarındaki damarlar kesilerek atılır ve yapraklar küçük parçalara ayrılır.

  3. Soğutulmuş havana alınır ve üzerine 15 ml soğuk izolasyon tamponu eklenerek iyice ezilir.

  4. Elde edilen homojenat çift katlı tülbentten geçirilerek bir beherin içine süzülür.

  5. Solüsyon 15 ml’lik santrifüj tüplerine konulur.

  6. 200 g’de 1 dakika santrifüj edilir. (+4 C) Pellette parçalanmamış hücreler ve hücresel kısımlar bulunur.

  7. Süpernatant temiz bir tüpe alınır ve 1000 g’de 7 dakika santrifüj edilir.(+4 C)

  8. Santrifüjden sonra pellette kloroplastlar toplanmıştır. Supernatant uzaklaştırılır ve her tüpe 0.5 ml soğuk izolasyon tamponu eklenir. Yavaşça kloroplastların tampon ile karışması sağlanır.

  9. Tüp ışıktan korumak amacıyla alüminyum folyo ile sarılarak buz üzerinde saklanır.

Not: Kullanılan tüm aletlerin soğuk olmasına dikkat edilir.

LABORATUVAR 4



KLOROFİL MİKTAR TAYİNİ

4.1. MATERYAL VE METOT:

Materyaller:

Kloroplast süspansiyonu

%90 Aseton

Spektrofotometre ve küvetleri

Santrifüj

Metot:

1. Bir pipet yardımıyla 1 ml kloroplast solüsyonu 15 ml'lik santrifüj tüpüne aktarılır. Üzerine 8 ml %90 aseton eklenir ve iyice karıştırılır.

2. Karışımın üzerine 1 ml saf su eklenir ve tekrar karıştırılır. 5 dakika 1000 g'de santrifüj edilir.

3. Supernatantın spektrofotometrede 652 nm dalgaboyunda ölçümü yapılır. (Blank olarak su kullanılır.)

4. 1 ml kloroplast süspansiyonundaki total klorofil miktarı aşağıdaki formüle göre hesaplanır.

mg klorofil




Absorbans

----------------

=

----------------

ml




34.5

5. Final klorofil konsantrasyonu 0.01 mg/ml olacak şekilde kloroplast solüsyonu dilue edilmelidir. Dilüsyon faktörü ölçüm sırasında hesaplamaya eklenmelidir.

6. Dilue edilmiş süspansiyonun ml'sindeki kloroplast sayısı hemositometre ile belirlenir.

LABORATUVAR 5



FOTOSENTEZ

Hill Reaksiyonu

5.1.MATERYAL VE METOT

Materyaller:

Kloroplast süspansiyonu

Su banyosu

Buz kovası

0.035 M NaCl

0.1 M K2HPO4/KH2PO4 tampon, pH6,5



1x10-6 DCPIP ( 2,6- diklorofenil- indofenol)

Metot:

  1. Final klorofil konsantrasyonu 0.01 mg/ml olacak şekilde 0.035 M NaCl ile sulandırılır ve buz kovasına konur.

  2. Sulandırılan süspansiyon 5 ml’si su banyosunda 5 dk kaynatılır ve buz kovasının içine konulur.

  3. Aşağıda tabloda verildiği gibi 4 tüp hazırlanır.






1

2

3

4

Tampon

3 ml

3 ml

3 ml

3 ml

Isıtılmış kloroplast

1 ml

1 ml

-

-

Aktif kloroplast

-

-

1 ml

1 ml

Saf su

2 ml

1 ml

1 ml

1 ml



  1. 1 nolu tüp blank(kör) olarak kullanılır. DCPIP boyası konulmaz.

  2. 1 ml DCPIP boyası 2 nolu tüpe eklenir ve hemen karıştırıcıda karıştırılıp 600 nm’de ölçüm alınır.

  3. 1 ml DCPIP boyası 3 ve 4 nolu tüpe eklenir ve hemen karıştırıcıda karıştırılıp 600 nm’de ölçüm alınır. Okuma zamanı kaydedilir.

  4. 4 nolu tüp alüminyum folyo ile sarılır. Bu tüp karanlık kontrolü olarak kullanılır ve bu solüsyonun absorbansı yalnızca deney sonunda ölçülür. Bu tüpe ışığın ulaşmaması çok önemlidir.

  5. 2 ve 3 nolu tüpler soğuk su banyosu içine konulur ve kuvvetli bir ışık kaynağı ile aydınlatılır.

  6. Her tüpün absorbans değerleri 10, 20 ve son olarak 30. Dakikada ölçülür.



Zaman (dakika)

2

3

4

0










10










20










30












  1. Aşağıdaki eşitlik kullanılarak 10 dakikadaki toplam boya azalması hesaplanır.

Co(Ao-Ac)

Cr=


Ao

Cr: azalan boya

Co: başlangıçtaki boya konsantrasyonu

Ao: karışımın başlangıçtaki absorbansı

Ac: karışımın deney sonuçlandıktan sonraki absorbansı


  1. Azalan boyanın yüzdesi hesaplanır.

LABORATUVAR 6



KAN HÜCRELERİNİN FRAKSİYONLANMASI

6.1. GİRİŞ

Kan vücutta kardiovasküler sistem dediğimiz  kalp ve damarlardan oluşan "dolaşım" sistemi içerisinde bulunur ve oksijen ,besin maddelerini, hormonları , vitaminleri ve antikorları dokulara taşıyan ve oluşan karbondioksit ve atık maddelerini vücuttan uzaklaştıran yaşamsal sıvıdır

Kan kabaca plazma dediğimiz sıvı ve şekilli elementlerden oluşur. Pıhtılaşması engellenmiş olan bir tüp kan santrifüj edilirse altta kırmızı küreler ve üstte plazma olmak üzere iki ana kısma ayrılır. Arada kan pulcukları (platelet-trombosit)  ve beyaz kürelerden oluşan çok ince bir hat kalır bu hatta " buffy coat"adı verilir. Plazma kanın yaklaşık % 55’ini oluşturur. Plazma içerisinde ; su , proteinler , ve diğer suda çözünen maddeler bulunur.

http://www.hematoloji.org.tr/files/image/kan/kan1.jpg

Şekil 6.1. Santrifüj Sonucu Kan

(http://www.hematoloji.org.tr/content.php?gid=20)

Beyaz kan hücreleri (lökositler) kırmızı kan hücrelerine göre daha az bulunur. Lökositler 2 temel gruba ayrılır:


  • Tek çekirdekli Hücreler (Mononükleer)

    • Lenfosit ( B ve T)

    • Monosit

  • Granülositler (Parçalı çekirdekli Hücreler)

    • Nötrofil

    • Bazofil

    • Eozinofil

Bütün lökositler amip gibi hareket etme özelliğine sahiptir. Kan damarlarından çıkarak çevre dokulara geçebilirler.



Granülositler:

  1. Nötrofil photo of neutrophil

Nötrofiller kan smear örneğinde en çok bulunan kan hücresidir. (%60-70) . Nötrofiller 3 tip granül içerirler:neutrophil diagram

  • Lizozom

  • Salgı granülleri

  • Glikoprotein ve jelatinaz

Nötrofiller kemik iliğinde üretilirler. Kanda 6-10 saat dolaştıktan sonra dokulara girerler. Nötrofiller hareketli ve fagositik özelliktedir. Hasarlı dokuları ve bakterileri yok ederler. İnflamasyonda oldukça önemlidirler.




  1. Eozinofiller

http://www.histology.leeds.ac.uk/blood/assets/eosinophil_d.gifeosinophil photo

Eozinofiller kan smear örneğinde nadir olarak bulunur. Toplam lökositlerin %1-6 sını oluşturur.

Bu hücreler kemik iliğinde üretilirler ve birkaç saat içinde periferal kan sistemine katılırlar. Kanda yüksek sayıda çıkan eozinofil alerjik reaksiyon göstergesidir.

Eozinofiller ayrıca parazitik kurtçukların öldürülmesinde rol oynamaktadır.



  1. Bazofil

Bazofiller kan smear örneğinde nadir olarak bulunur. Toplam lökositlerin %1 ini oluşturur. basophilbasophil diagram

Bu hücreler parazitlere karşı immun cevabın en önemli elemanlarındandır. Bazofiller enfeksiyon olan bölgede birikirler ve inflamasyon cevapta rol oynarlar.



Agranülositler :

  1. Lenfosit :

lymphocytehttp://www.histology.leeds.ac.uk/blood/assets/lymphocyte_d.gif

Lenfositler beyaz kan hücrelrinin %20-50 ‘ sini oluşturur ve kan smear örneğinde yaygın olarak gözlenir.

Lenfositlerin B- ve T- hücreleri olmak üzere iki çeşidi vardır. B hücreleri kemik iliğinde gelişir. T hücreleri ise kemik iliğinde üretilir ama gelişimlerini timusta tamamlarlar.

B hücreleri antikor üreten plazma hücrelerine gelişirler.

T hücreleri virüslere ve kanser hücrelerine saldırmada görev alırlar.


  1. Monosit: monocytehttp://www.histology.leeds.ac.uk/blood/assets/monocyte.gif

Monositler beyaz kan hücrelerinin %2-10 ‘unu oluştururlar.

Monositler 1-3 gün arasında kanda dolaştıktan sonra dokulara göç ederler ve makrofajlara dönüşürler. Makrofajlar ise ölü hücreleri ve bakterileri fagosite ederler. Bazı monositler osteoklastlara da dönüşebilir.



6.2. MATERYALLER VE METOT

Materyaller :

Mikroskop

Giemsa boyası

Alkol (%70)

Lâm

Metot:


      1. Temiz bir lama bir damla konulur.

      2. Başa bir lam ile bu kan yayılır. ( Smear )

      3. Lam oda sıcaklığında kurumaya bırakılır.

      4. Lam mikroskopta incelenerek gözlenen şekiller deftere çizilir.

      5. Preparatın üzerine birkaç damla Giemsa boyası damlatılır ve 5 dk bekletilir.

      6. Boyama yapılan preparat distile su ile yıkanır.

      7. Lamın alt yüzeyi kurutma kağıdı ile silinir ve kurumaya bırakılır.

      8. Preparat mikroskopta incelenerek gözlenen şekiller deftere çizilir.

Not: Defterlere gözlenen tüm akyuvar şekilleri çizilir ve çekirdekleri karşılaştırılır.

LABORATUVAR 7



HÜCRE KÜLTÜRÜ I

7.1. HÜCRE KÜLTÜRÜNE GİRİŞ

Hücre kültürü, hücrelerin kontrollü şartlar altında yetiştirilmesi sürecidir. In vivo (canlı ortam)’ da yapılamayan bazı çalışmalar hücre kültürü teknikleri yardımıyla sonuçlara ulaşmaktadır. Örneğin kanser çalışmalarında belli bir maddenin etkisi çalışılabilir ya da hücre veya doku tarafından üretilen maddelerin işlevleri hücre kültürü sayesinde belirlenebilir.

Hücre kültürü çalışma alanları :

  • Kanser araştırmaları

  • Sitogenetik, biyokimyasal, moleküler biyolojik çalışmalarda

  • Çeşitli hastalıkların tanı ve araştırılmasında

  • Doku ve deri mühendisliği

  • Aşı üretimi

  • Kök hücreler

  • Farmasötik proteinlerin üretimi

  • Tüp bebek ve kısırlık tedavileri

Hücre kültürü çalışmalarında kullanılan her materyalde ve ekipmanda sterilite oldukça önemlidir.

Steril Kültür Koşulları • Ayrı Bir Oda

• Class II Biyogüvenlik Kabini

• Ters Mikroskop

• Pipet Seti

Hücre kültürü besiyerleri laboratuar ortamında hücrelerin normal metabolik aktivitelerini sürdürebilmeleri için gerekli olan mikroçevreyi sağlayan besleyici solusyonlardır. Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki aminoasit, karbonhidrat, vitamin ve iyonlarla hücrelerin gelişimini desteklerler. Laboratuar ortamında hücrelerin çoğaltılabilmesi için uygun pH, sıcaklık ve nemin sağlanması çok önemlidir. Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki iyonlarla gerekli ozmolarite ve pH’ı da sağlarlar.

Besiyerlerinde genellikle pH indikatörü olarak fenol kırmızısı bulunur

Sarımsı asidik besiyeri ; Fazla üremiş kültürü, bakteri kontaminasyonunu, fazla CO2’i işaret ediyor olabilir.

Morumsu bazik besiyeri ; Ürememiş kültürü , Küf kontaminasyonunu , Az CO2’i işaret ediyor olabilir.



  • Besiyeri kullanılmadan önce 37oC’ye ısıtılmalıdır. (Su banyosunun içinde yaklaşık 10 dak).

  • Besiyerinin içindeki bazı bileşenler (antibiyotik) uzun süre sıcakta beklemeye dayanıklı değildir.

  • Serumun yüzdesi %5-20 arasında olmalıdır.

  • Serumun tipi: Standart olan bovine serum (dana serumu) dur. Fetal bovine serum( FBS) (fetal dana serumu ) da tercih edilir.

Hücre Çeşitleri

1.Süspansiyon hücreler:

Süspansiyon hücreler ortamda asılı durmuş şekilde büyürler. Bu hücreler, kültür şişesine bağlanmadan hayatta kalabilir ve çoğalabilirler. Kan, dalak, kemik iliği ve özellikle tam gelişmemiş hücreler süspansiyon şeklinde büyüme eğilimindedirler. Süspansiyon içindeki hücreler küçük toplar gibi görünürler. Süspansiyon büyümenin avantajı çok sayıda hücreyi büyütebilmek ve kolayca kültürden toplayabilmektir.



http://www.integra-biosciences.com/sites/us/images/cellspin.jpg

Şekil 7.1. Süspansiyon hücre kültürü

2.Yapışkan(Adherent) hücreler:

Yapışkan hücreler tek tabaka halinde, yüzeye tutunarak büyürler. Ektodermal ve endodermal embryonik hücre tabakalarından türeyen hücreler yapışkan bir şekilde büyüme eğilimindedirler. Bunlar, fibroblast ve epitel hücrelerini içerir. Yapışkan hücreler değişik şekillerde olabilirler, fakat genellikle düzdürler. Süspansiyon halde büyütülen aynı hücreler yuvarlak olabilirler. Yapışkan büyümenin avantajı, hücreleri lamel gibi yüzeylere yayabilmek ve yapıştırabilmektir. Bu özellikler, mikroskop, hibridizasyon ve fonksiyonel testlerde kolaylık sağlar.



http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/product5/020/cls3815.tif/_jcr_content/renditions/cls3815-medium.jpg

Şekil 7.2. Adherent hücre kültürü

https://s3-eu-west-1.amazonaws.com/ppreviews-plos-725668748/548207/preview.jpg

http://image.slidesharecdn.com/manipulationofcelldeath11-02-15-150222091107-conversion-gate01/95/manipulation-of-cell-death-11-0215-15-638.jpg?cb=1424617923 http://image.slidesharecdn.com/manipulationofcelldeath11-02-15-150222091107-conversion-gate01/95/manipulation-of-cell-death-11-0215-15-638.jpg?cb=1424617923

Şekil 7.3. Adherent ve süspansiyon (Non-adherent) hücre kültürü

Temel Hücre Kültürü Teknikleri

  1. Donmuş Hücreleri Kültüre Etme

Ökaryotik hücreler genelde serum ve dondurma işleminde kullanılan katkı maddesi içeren ortamda, sıvı nitrojen içinde -196°C’de saklanır. Hücreler, eğer bir firmadan satın alındıysa kuru buz içindeki bir ampülde ulaşır. Donmuş hücreler, maksiumum canlılık elde etmek için en kısa zamanda hızlı bir şekilde çözülmelidir. Dondurmak için kullanılan katkı maddesinden kurtulmak için ortam 24 saat sonra değiştirilmelidir.

Prosedür

1. Ampül, 37°C’lik su banyosunda tutulur ve hızlıca çalkalanır. 1 dakika içinde buzu çözülecektir.

2. Buzları çözülmüş olan ampül, %70 etanol içeren beherin içine bırakılır ve laminar akımlı kabine yerleştirilir. 3. Ampül, etanolün içine girmesi engellenecek şekilde açılır.

4. Ampülün içi kültür şişesine boşaltılır ve hemen ardından üzerine ısıtılmış ortam eklenir.

5. Kültür şişesinin kapağı kapatılır ve 24 saat inkübe edilir.

6. Şişedeki ortam yenileneir.

7. 2-3 gün ya da belirtilen süre boyunca inkübe edilir.

2. Hücre Bakımı Hücre Hatlarının Rutin Bakımı

• Besleme: Büyümeleri sırasında, hücreler bazı maddeleri tüketirler; bunlar belli aralıklarla yenilenmelidir. • Aktarım: Hücre sayısı büyüme boyunca artar ve kültür şişesinin kapasitesini aşar. Bu yüzden, hücreler belli aralıklarla yeni şişelere aktarılmalıdır.

• Dondurma: Her ne zaman yeni bir hücre hattı elde edilirse bir kısmı dondurularak saklanmalıdır. Bu hücreler, kullanılan kültürün kontamine olması ya da zarar görmesi halinde yedek olarak kullanılacaklardır. Hücreler, ne kadar hızlı büyürlerse o kadar sık beslenmeli ve yeni şişelere aktarılmalıdır.

Antibiyotikler, kontaminasyona karşı bazı lablarda rutin olarak kullanılır; fakat aseptik kuralara gereğince uyuluyorsa antibiyotik kullanılımına gerek olmayabilir. Hücre kültüründe kullanılan iki standart antibiyotik: -Gentamisin 5-10 mg/ml stok, 50µg/ml son konsantrasyonda -Penisilin (10.000 ünite)/ Streptomisin (10mg/ml) stok, 100 ünite/ml ve 100µg/ml son konsantrasyonda



Yapışkan Hücrelerin Bölünmesi ve Aktarılması

Prosedür

1. Hücre tabakasının üzerindeki ortam çekilir.

2. PBS ve serum içermeyen kültür ortamı 37°C’ye ısıtılır. Ortam, doğrudan hücrelerin üzerine değil kültür şişesinin duvarına doğru pipetlenir. Böylelikle tam yapışmamış hücreleri yerinden oynatmaktan kaçınılmış olur.

3. PBS ve ortam hücre tabakasının üzerinden çekilir.

4. Hücrelerin yüzeyini kaplayacak miktarda %0,25 tripsin/PBS eklenir.

5. Tripsin yaklaşık 10-30 saniye sonra hücrelerin üzerinden çekilir.

6. Hücreler oda sıcaklığında 5-15 dakika boyunca inkübe edilir. Bu süre içinde birkaç dakikada bir tüm hücre tabakasının yüzeyden ayrılıp ayrılmadığı kontrol edilir. Bu basitçe hücre şişesini eğerek hücre tabakasının hareketi gözlenerek yapılabilir. Eğer tüm tabaka ayrıldıysa inkübasyon bitirilebilir. Alternatif olarak, daha sonra hücreler 37°C’de 5 dakika süreyle inkübe edilebilir.

7. Hücrelerin üzerinden çekilen kadar yeni ortam eklenir ve hücre öbeklerini kırmak için şiddetli bir şekilde pipetaj yapılır.

8. 1 ml hücre mikrofüj tüpüne alınır.

9. Hücreler mikroskopta sayılır.

10. Hücrelerin ne kadar seyreltilmesi gerektiğine ve ekim konsantrasyonuna karar verilir.

11. Karar verilen miktarda hücre, yeni şişeye aktarılır.

12. Hesaplanan miktarda önceden 37°C’ye ısıtılmış yeni ortam, hücrelerin üzerine eklenir.

13. Kültür şişesi nazikçe çevrilir ve hücrelerin eşit şekilde dağılması sağlanır.

14. Kapağın kapalı olduğundan emin olunduktan sonra hücreler inkübatöre yerleştirilir.

Süspansiyon Hücrelerin Bölünmesi ve Aktarılması

Prosedür

1. Kültür şişesi yavaşça sallanır ve hücrelerin eşit dağılması sağlanır. 1 ml hücre mikrofüj tüpüne alınır.

2. Hücreler, mikroskopta sayılır. Sayım sırasında hücrelerin genel durumu da kontrol edilir.

3. Hücrelerin ne kadar seyreltilmesi gerektiğine ve ekim konsantrasyonuna karar verilir.

4. Karar verilen miktarda hücre, yeni şişeye aktarılır.

5. Hesaplanan miktarda önceden 37°C’ye ısıtılmış yeni ortam, hücrelerin üzerine eklenir.

6. Kapağın kapalı olduğundan emin olunduktan sonra hücreler inkübatöre yerleştirilir.

7. Orijinal şişe de yedek olarak üzerine ortam eklenmeksizin inkübatöre tekrar koyulur. Her aktarım sırasında orijinal şişenin yedek olarak saklanması olası bir kontaminasyona karşı önlem olarak kullanılır. Her aktarımdan sonra daha önceki yedek şişe atılır ve yeni yedek şişe onun yerine inkübe edilir.



Canlı Hücrelerin Mikroskopta Sayılması

Đncelenecek hücreler tripan mavi ile boyanır. Bu boya, canlı hücreler tarafından dışarı atılırken ölü hücreleri koyu mavi renge boyar. Hücreler, hematositometre olarak adlandırılan bir çeşit bölmeli lama damlatılır ve bunun üzerinde mikroskop altında tek tek sayılır.



3.Hücrelerin Dondurulması ve Saklanması

Hücreler büyüdükçe fenotipleri değişebilir. Hücrelerin değişmeden tahmin edilebilir bir durumda bulunmaları gerektiği için hücreler en kısa zamanda dondurularak saklanmalıdır.



Prosedür

1. Hücreler her zaman büyütüldükleri ortam ve serumda logaritmik faza kadar büyütülür.

2. Canlı hücre sayımı yapılır. Dondurulacak hücrelerin %20’sinden fazlasının ölü olmamasına dikkat edilir.

3. Ne kadar hücreye ve ampüle ihtiyaç duyulacağına karar verilir. Her ampül, 1ml ortam içinde 1 x 107 (ya da 4 X 106 ile 2 X 107 hücre arası ) hücre alabilir.

4. Dondurma ortamı her tüpte 1ml artı %10 olacak şekilde hazırlanır. Dondurma ortamı genelde normal kültür ortamı, %10-20 serum ve %5-10 gliserol veya DMSO içerir. Eğer hangi dondurma ortamı kullanılacağına karar verilemiyorsa hücreler %20 serum ve %10 DMSO’da dondurulabilir.

5. Pelet, dondurma ortamında pipetaj yapılarak çözülür.

6. Hücreler, her ampüle 1ml düşecek şekilde ampüllere dağıtılır ve buzda tutulur.

7. Ampüller buzlukta saklanacak bir kutuya yerleştirilir ve -60°C veya daha düşük bir sıcaklıktaki dondurucuda 16 ile 24 saat arası bekletilir.

8. Bir buz kovasına bir miktar sıvı azot dökülür ve tüpler, sıvı nitrojen tankına aktarılmadan önce burada tutulur.

9. Tüpler yerleştirildikten sonra nereye koyuldukları kaydedilir.



KONTAMiNASYON

Kontaminasyon bakteriden, mayadan, mantardan, mikoplazmadan ve diğer doku kültürlerinden kaynaklanabilir.



Makroskopik olarak: Kültür şişesini veya kabını ışığa tutularak şunlara dikkat edilerek incelenir:

• Bulanıklık: Kültür yoğun olsa bile, ortamın rengi bulanık değil, net bir şekilde görünmelidir. Ortamdaki bulanıklık ve kısım kısım hareket eden renk tonu farklılıkları dikkatle incelenmelidir. Bazı mantarlar ortamda yüzen koloniler oluşturabilirler.

• Ortamdaki renk değişikliği. Fenol kırmızısının etkisiyle kırmızı renkli olan kültür, asidik koşullarda sarıya, bazik koşullarda ise mora döner. Bakteriyel kontaminasyon ortamı sarıya, mantar kontaminasyonu ise pembeye dönüştürür.

• Koku: Şişenin kapağı açılmadan burun şişeye yaklaştırılır. Birçok kontaminasyonun fark edilebilir bir kokusu vardır.



Mikroskopik olarak: Kültür şişesi öncelikle 10X mikroskopta şunlara dikkat edilerek incelenir:

• Diğer organizmalar: Düşük büyütme gücünde, mantar miselleri uzun zincirler olarak gözlenir. Bu büyütmede mayalar da küçük toplar halinde, bazen de tomurcuklu bir şekilde görülebilirler. Yüksek büyütme gücünde bakteriler gözlenebilir. Bakteriler çubuk, kok, tek veya zincirlenmiş öbekler halinde olabilirler.

• Zarar görmüş hücreler:Enfeksiyon, hücreleri öldürebilir. Her hücrenin parçalanmasına ve/veya hücre tabakasının yüzeyde kalkmasına sebep olabilir. Çoğu zaman hücreler normalde olduklarından daha garip görünürler. Daha küçük veya daha büyük ya da koyu renk granüllü olabilirler.

Çapraz Kontaminasyon: Hücreler, diğer kültürleri enfekte edebilirler. Bu çapraz kontaminasyon oldukça yaygındır; fakat şunlar yapılarak çapraz kontaminasyondan kaçınmak mümkündür:

• Hücreler, daha önceden bilinen ve güvenilen bir yerden alınmalıdır.

• Aynı anda iki farklı hücre hattıyla çalışılmamalıdır.

• Aynı pipet farklı hücre hatları için kullanılmamallıdır.

• Aynı ortam ya da tripsin şişesi farklı hatlar için kullanılmamalıdır.

• Bir pipet, hücrelerin olduğu şişede kullanıldıktan sonra ortam şişesine tekrar sokulmamalıdır. Eğer hücreler aniden hızlı bir şekilde büyümeye başlarsa veya normalden farklı davranmaya başlarsa, mikoplazma kontaminasyonu olmadığı ttespit edildikten sonra çapraz kontaminasyon için kontrol edilmelidir.

LABORATUVAR 8

HÜCRE KÜLTÜRÜ II

8.1.GİRİŞ

Hücre canlılığının ve çoğalmasının ölçülmesi birçok in vitro yönteminin temelini oluşturmaktadır.

Hücre büyümesinin belirlenmesi geleneksel yöntemlerde canlı hücrelerin boyanmasının ardından sayılmasına dayanmaktadır. Tripan mavisi bunun için kullanılan basit bir yöntemdir fakat bu methodun duyarlılığı düşüktür

Tetrazolium tuzlarının indirgenmesi ile hücre çoğalmasının belirlenmesi artık kabul gören güvenilir bir yöntem.

Sarı renkli tetrazolium MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) metabolik olarak aktif hücrelerde dehidrogenaz enzimi aktivitesiyle indirgenerek mor renkli formazan oluşturur. Bu renkli bileşenin absorbansı spektrofotometrede ölçülerek analiz edilebir. ( genellikle 500-600 nm aralığında)

Bu redüksiyon sadece mitokondriyal redüktaz enzimler aktif olduğunda gerçekleşmektedir. Dolayısıyla bu dönüşüm canlı hücre sayısıyla doğrudan ilişkilidir.





file:tetrazolium reduction.png

Şekil 8.1. MTT Reaksiyonu

Canlı hücrelerde mitokondriyal dehidrogenazlar tetrazolium halkasını parçalayarak mor renkli MTT formazan kristallerini oluşturur. Formazan kristalleri sulu çözeltilerde çözünmezler. Mor renkli bileşik spektrofotometrede ölçülerek analiz edilebir. Hücre sayısındaki artış MTT formazan oluşumda artışa neden olacaktır. Bunun sonucunda da absorbansta artış gözlenecektir.

MTT yöntemi mitogen, antijenik stimuli, büyüme faktörleri ve diğer büyümeyi tetikleyici faktörlere karşı hücre büyümesinin ölçülmesinde sitotoksisite çalışmalarında ve hücre büyüme eğrisi çalışmalarında kullanılan oldukça kullanışlı bir yöntemdir. Ancak bu yöntem hücrelerin fizyolojik durumlarından, mitokondriyal dehidrogenaz aktivitesindeki değişimlerden etkilenmektedir.

MTT Protokol:



  1. Hücreler 96-well plate lere ekilir.

  2. 20 ml 5 mg/ml MTT solüsyon eklenir, iyice karıştırılır.

  3. 37 C inkübatörde 4 saat inkübe edilir.

  4. Medium dikkatli bir şekilde uzaklaştırılır ve 100 ml DMSO eklenir.

  5. 570 nm de absorbans ölçülür.

file:mtt plate.jpg

LABORATUVAR 9



İMMÜNOHİSTOKİMYA

9.1.GİRİŞ

İmmunohistokimya antijen-antikor reaksiyonu ile spesifik hücre ya da doku bileşenlerinin tanımlanması prosedürüdür. İşaretli antikorlar kullanılarak dokulardaki antijenlerin lokalizasyonunu ve dağılımlarını görmeyi mümkün kılar.

İmmunohistokimya spesifik antijen-antikor reaksiyonuna dayalı olarak gerçekleştiğinden diğer enzim boyama yöntemlerine göre daha avantajlıdır. Bu yüzden pek çok araştırma laboratuvarlarında kullanıldığı gibi klinik tanılarda da sıkça kullanılmaktadır.
İMMUNOHİSTOKİMYA ADIMLARI


  1. Doku hazırlanması




  1. Fiksasyon:

Doku hazırlaması immunohistokimyanın en önemli basamağıdır. Dokunun ve hücrenin morfoloji ve yapısının korunması için hızlı ve uygun bir fiksasyon yapılması çok önemlidir. Fiksasyonda yapılan hatalar antikor bağlanma kapasitesini düşürümektedir.


fiksasyonda kullanılan tek bir fiksatif ajan yoktur. Genellikle formalin ile fikse edilmiş parafin gömülü doku kesitleri kullanılır.
İmmunohistokimyada yaygın olarak kullanılan fiksatifler :
a) 4% paraformaldehit

b) 2% paraformaldehit + 0.2% pikrik asit

c) PLP fiksatif: 4% paraformaldehit, 0.2% periyodat and 1.2% lizin

d) 4% paraformaldehit + 0.05% glutaraldehit

 


  1. Kesit alma :

Fikse edilen dokulardan kesit alabilmek için öncelikle doku tespitinin yapılması gerekir. Histoloji çalışmalarında doku tespitinde en çok kullanılan ajan parafindır. Parafin içerisine gömülen dokudan kesit almak için özel cihazlar kullanılır.yaygın olarak kullnılan cihazlar mikrotom ve kriyostattır. Alınan kesitlerin kalınlığı 4-40 mm aralığında olabilir.


  1. Antijenlerin açığa çıkarılması (antigen retrieval)


Formalin fiksasyonu sırasında oluşan protein çapraz bağları antijenik bölgeleri kapatmaktadır. Bu yüzden antijenlerin tekrar açığa çıkarılması için gerekmektedir. Bu amaçla iki yöntem kullanılabilir:

1. Isıtma "Heat Induced Epitope Retrieval (HIER)".

2. Enzimatik parçalama "Proteolytic Induced Epitope Retrieval (PIER)".


  1. Bloklama :

Fiksasyonun uygun olmayan işekilde yapılması yalancı pozitif sonuçlara neden olabileceği için bunu önlemek amacıyla bloklama yapılması gerekmektedir.

Pek çok dokuda endojen peroksidaz aktivitesi bulunmaktadır. Fikse edilen doku kesitleri DAB substratı ile reaksiyona girdiğinde dokudaki endojen peroksidaz aktivitesi yalancı pozitif sonuç verecektir. Bu yüzden kesitler primer antikordan önce hidrojen peroksidaz ile muamele edilerek bloklama yapılmalıdır.

Eğer işaret olarak alkalin fosfataz(AP) kullanılacaksan yine birçok dokuda bulunan endojen alkalin fosfataz aktivitesi de levamisol ile bloklanmalıdır.


  1. Primer Antikor İle Muamele

Immunohistokimyasal boyamada en önemli basamaklardan biri antibodylerin hedef proteinleri tanımasıdır.

Antibodyler oldukça spesifik bağlanma gösterdiklerinden yalnızda dokudaki hedef proteinleri tanırlar.



  1. Sekonder Antikor İle Muamele

Secondary antibodyler duyarlılığın artmasını sağlarlar.

  1. Kromojen Reaksiyonu

Antibodiler mikroskop altında görünür değildirler bu yüzden işaretlenmeleri gerekir. Ancak işaretleme yaparken antibodynin bağlanma spesifikliğini etkilememek oldukça önemlidir.

Antibody- antijen bağlanmasını görünür duruma getirmek için çeşitli belirleme yöntemleri kullanılır.



Kromojenik belirleme : Antibodye bağlı olan enzim substratı ile reaksiyona girerek proteinin bulunduğu yerde renkli bir ışıma verir.

Florosan belirleme : Antibodye bağlı olan florofor, florasan mikroskobu yardımıyla görünür.

Kullanılan işaretler:



  • fluorochromes ( fluorescein, rhodamine),

  • Enzimler ( peroxidase, alkaline phosphatase)

  • Elektron saçan bileşenler (Elektron mikroskobu ile görüntüleme için) ( ferritin, colloidal gold)



  1. Arka Plan Boyama

Hedef antijenin immunohistokimyasal boyanmasının ardından boyamanın daha belirgin olması için ikinci bir boyama işlemi yapılır. Bu boyaların çoğu belirli hücresel komponentlere ve antijenlere spesifiklik gösterirken bir kısmı bütün hücreyi boyayabilir.

  1. Preparat Kapatma

Tüm immunohistokimyasal boyama işlemleri bittikten sonra örneklerin uzun süreli kullanımı ve saklanması için korunması gerekmektedir. Bu amaçla boyanmış doku kesitini lam üzerine sabitlemek/mühürlemek için çeşitli stabilizatörler kullanılır.

İMMUNOHİSTOKİMYASAL METOTLAR



Direkt method

Direkt method tek bir adımda boyama metodur. İşaretlenmiş antibody doku üzerindeki antijen ile direk olarak reaksiyona girer.

Bu metotda tek bir antibody kullanılır.

Prosedür kısa ve hızlıdır.

Duyarlılığı düşüktür.

Nadir kullanılır.

İndirekt metotudun giriş kısmında kullanılır.
Indirekt method

İşaretlenmemiş primer antibody doku antijeni ile reaksiyona girer.İşaretlenmiş sekonder antibody ise primer antibody ile reaksiyona girer.

Duyarlılığı yüksektir.

Sekonder antibody FITC, rhodamine or Texas red gibi florasan boyalarla işaretlenebilir.( indirect immunofluorescence method )

Sekonder antibody peroxidase, alkaline phosphatase or glucose oxidase gibi enzimlerle işaretlenebilir.( indirect immunoenzyme method.)
PAP method

PAP method indirekt metoda üçüncü bir adım eklenerek geliştirilmiştir.Üçüncü adımda peroksidaz antibodysi peroksidaz ile reaksiyona girerek peroksidaz-antiperoksidaz kompleksini oluşturur.

Peroksidaz molekülünden dolayı duyarlılık 100 ile 1000 kat arasında artmaktadır. Çünkü peroksidaz molekülü anti IgG ‘ye sadece immunolojik olarak bağlanır ve düşük primer antibody konsantrasyonlarında bile aktivitesini korur bu sayede istenmeyen antibodyler uzaklaştırılır ve non-spesifik bağlanma engellenmiş olur.

Avidin-Biotin Complex (ABC) Method:

ABC method immunohistokimyada en sık kullanılan boyama metotlarından biridir.

Avidin( büyük glikoprotein) peroksidaz veya fluorescein ile işaretlenebilir ve biyotin molekülüne yüksek affinite gösterir.

Bu teknik üç katmanlı olarak gerçekleştirilir.



İlk katman işaretlenmemiş primer antibody, ikinci katman biyotinlenmiş sekonder antibody ve

üçüncü katman avitim-biyotin peroksidaz kompleksidir. Peroksidaz daha sonra DAB veya diğer substratlar ile reaksiyona girerek renkli bileşenler oluşturur.


Поделитесь с Вашими друзьями:


Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©www.azkurs.org 2019
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə