Antigen clasping by two antigen-binding sites of an exceptionally specific antibody for histone methylation



Yüklə 151,91 Kb.
Pdf görüntüsü
tarix31.03.2017
ölçüsü151,91 Kb.
#13018

Antigen clasping by two antigen-binding sites of an

exceptionally specific antibody for histone methylation

Takamitsu Hattori

a

, Darson Lai



a

, Irina S. Dementieva

a

, Sherwin P. Montaño



a

, Kohei Kurosawa

a

, Yupeng Zheng



b,c,d

,

Louesa R. Akin



a

, Kalina M. 

Swist-Rosowska

a,e


, Adrian T. Grzybowski

f

, Akiko Koide



a

, Krzysztof Krajewski

g

,

Brian D. Strahl



g

, Neil L. Kelleher

b,c,d

, Alexander J. Ruthenburg



a,f

, and Shohei Koide

a,1

a

Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Chicago, Chicago, IL 60637;



b

Department of Chemistry, Northwestern University,

Evanston, IL 60208;

c

Department of Molecular Biosciences, Northwestern University, Evanston, IL 60208;



d

Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern

University, Evanston, IL 60208;

e

Department of Biochemistry, Faculty of Chemistry, Wroc



ław University of Technology, 50-370, Wrocław, Poland;

f

Department of Molecular Genetics and Cell Biology, The University of Chicago, Chicago, IL 60637; and



g

Department of Biochemistry and Biophysics,

University of North Carolina School of Medicine, Chapel Hill, NC 27599

Edited by David Baker, University of Washington, Seattle, WA, and approved January 19, 2016 (received for review November 16, 2015)

Antibodies have a well-established modular architecture wherein

the antigen-binding site residing in the antigen-binding fragment

(Fab or Fv) is an autonomous and complete unit for antigen

recognition. Here, we describe antibodies departing from this

paradigm. We developed recombinant antibodies to trimethylated

lysine residues on histone H3, important epigenetic marks and

challenging targets for molecular recognition. Quantitative char-

acterization demonstrated their exquisite specificity and high

affinity, and they performed well in common epigenetics appli-

cations. Surprisingly, crystal structures and biophysical analyses

revealed that two antigen-binding sites of these antibodies form

a head-to-head dimer and cooperatively recognize the antigen in

the dimer interface. This

“antigen clasping” produced an expan-

sive interface where trimethylated Lys bound to an unusually

extensive aromatic cage in one Fab and the histone N terminus

to a pocket in the other, thereby rationalizing the high specificity.

A long-neck antibody format with a long linker between the anti-

gen-binding module and the Fc region facilitated antigen clasping

and achieved both high specificity and high potency. Antigen clasping

substantially expands the paradigm of antibody

–antigen recog-

nition and suggests a strategy for developing extremely specific

antibodies.

antibody engineering

|

epigenetics



|

antibody validation

|

protein


–protein interaction

|

data reproducibility



T

he antigen-binding site of conventional immunoglobulins (Igs)

is primarily composed of six complementarity-determining

regions (CDRs) located in the VH and VL domains (Fig. 1A).

Antibody fragments such as Fab and Fv are viewed as an au-

tonomous unit containing a single, complete site for antigen

recognition (1). The 1:1 stoichiometry of the antigen and Fab

(or Fv) is conserved among known antibody structures and

isotypes, including the

“two-in-one” antibodies whose Fab spe-

cifically binds to two distinct antigens, but one at a time (2). This

paradigm has been a guiding principle in the engineering of di-

verse antibody formats such as bispecific antibodies (3).

The terminal regions of histone proteins (

“histone tails”) are

unstructured and contain many posttranslational modification

(PTM) sites that are recognized by epigenetic regulatory machin-

eries involved in transcriptional regulation (4, 5). Antibodies to

histone PTMs are essential tools for epigenetics research, but

limited validation and large lot-to-lot variation of currently avail-

able anti-histone PTM antibodies are major sources of low

reproducibility (6

–9). The challenge in achieving high specificity and

affinity can be reasoned by minute differences among chemical

moieties of PTMs, as small as a single methyl group, and sequence

similarity surrounding modification sites (e.g., those encompassing

H3K9 and H3K27) (

SI Appendix, Fig. S1

) and by the fundamental

challenge in recognizing flexible polypeptides due to unfavorable

entropic changes associated with binding. Highly specific recombinant

antibodies to histone PTMs, with their essentially infinite re-

newability, could fundamentally eliminate this major limitation (9).

The limited understanding of the molecular mechanisms un-

derlying the recognition of histone PTMs has severely limited

our ability to apply mechanism-based designs to the generation

of recombinant antibodies to a wider range of histone PTMs. For

example, it is unknown whether existing anti-histone PTM anti-

bodies and natural

“reader” proteins use similar mechanisms.

Crystal structures of antibody

–antigen complexes are critical

information for structure-guided design and engineering of an-

tibody affinity and specificity (2, 10). In this study, we isolated

highly specific and potent antibodies to trimethylated Lys4 and

Lys9 on histone H3 (abbreviated H3K4me3 and H3K9me3, re-

spectively) that are exquisitely specific, potent, and fully vali-

dated in standard epigenetics applications. Further, we describe

the crystal structures of both antibodies in complex with their

respective targets. Their structural and functional analyses revealed

an unprecedented mechanism of antigen recognition where two

antigen-binding sites cooperatively recognize one antigen.

Significance

Extensive studies of the structure

–function relationship of

antibodies have established that conventional immuno-

globulins contain two copies of the antigen-binding frag-

ment (Fab), each of which serves as an autonomous and

complete unit for recognizing an antigen. In this paper, we

report a previously unidentified mode of antibody

–antigen

recognition, dubbed

“antigen clasping,” where two antigen-

binding sites cooperatively clasp one antigen, and the design

of a long-neck antibody format that facilitates antigen

clasping. Antigen clasping led to recombinant antibodies for

histone posttranslational modifications with extraordinarily

high specificity, valuable tools for epigenetic research. This

study substantially broadens the long-standing paradigm

for antibody

–antigen recognition.

Author contributions: T.H., K. Kurosawa, Y.Z., A.K., N.L.K., A.J.R., and S.K. designed research;

T.H., D.L., I.S.D., S.P.M., K. Kurosawa, Y.Z., L.R.A., K.M.

S.-R., and A.T.G. performed

research; K. Krajewski and B.D.S. contributed new reagents/analytic tools; T.H., Y.Z.,

A.T.G., N.L.K., A.J.R., and S.K. analyzed data; and T.H. and S.K. wrote the paper.

Conflict of interest statement: T.H., A.K., and S.K. are named as inventors in a patent

application filed by the University of Chicago on the described materials.

This article is a PNAS Direct Submission.

Freely available online through the PNAS open access option.

Data deposition: The atomic coordinates and structure factors have been deposited in the

Protein Data Bank,

www.pdb.org

[PDB ID codes

4YHP

(309M3-B with the H3K9me3 peptide),



4YHY

(309M3-B with Kme3), and

4YHZ

(304M3-B with the H3K4me3 peptide). ChIP-seq data



have been deposited in the Gene Expression Omnibus (GEO) database,

www.ncbi.nlm.nih.

gov/geo

(accession no.



GSE66530

).

1



To whom correspondence should be addressed. Email: skoide@uchicago.edu.

This article contains supporting information online at

www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.

1073/pnas.1522691113/-/DCSupplemental

.

2092


–2097

|

PNAS



|

February 23, 2016

|

vol. 113


|

no. 8


www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1522691113

Results

Generation of Recombinant Antibodies to Trimethylated Histone H3.

We generated recombinant antibodies to H3K4me3 and H3K9me3

by using directed evolution methods that mimic the processes

underlying the natural immune system: i.e., generation of low

affinity and specificity clones followed by maturation. We have

previously identified an antibody that weakly but specifically

recognizes trimethyl Lys, termed

“clone 4-5”, from a naive

human antibody library (9). Then, we generated a single chain

Fv (scFv) phage-display library where we diversified a subset

of CDR residues (

SI Appendix, Fig. S1

) (9). After procedures

that led to our initial success in targeting H3K9me3 (9) that in-

volved rounds of stringent selection for specific binding to histone

peptides, we isolated new antibodies to H3K9me3 and H3K4me3,

termed 309M3-B and 304M3-B, respectively.

We then produced these antibodies in the form of Fab and

subjected them to extensive validation. They showed apparent

dissociation constants (K

D

s) of 2 nM and 11 nM to their cognate



peptide, respectively, as measured with the peptide immunopre-

cipitation (IP) assay (8). The reason for using the term

“apparent” is

described in the next section. They had almost no detectable

binding to most other peptides tested, indicating high affinity

and exquisite specificity (Fig. 1 B and C). 309M3-B was more

sensitive to modifications of adjacent residues than our first

recombinant antibody to H3K9me3, termed 309M3-A, which

we reported previously (9), indicating that 309M3-B recognizes many

features of the H3K9me3 peptides outside the K9me3 site itself (

SI

Appendix, Fig. S1



). Similarly, 304M3-B preferentially recognized

unmodified forms of R2, T3, and T6 residues (

SI Appendix, Fig.

S1

). Characterization by IP-mass spectrometry (IP-MS) demon-



strated that both antibodies specifically enriched their cognate

targets from a mixture of synthetic peptides (Fig. 1D) (note that

the apparent enrichment of unmodified H3K4 and H3K9 was an

artifact due to experimental limitations) and from natural histone

extracts (

SI Appendix, Fig. S2 and Table S1

). The exquisite spec-

ificity of both antibodies was further validated by using internal

standard calibrated chromatin immunoprecipitation followed by

sequencing (ICeChIP) that allows quantitative assessment of spec-

ificity in the ChIP format using semisynthetic nucleosomes (11) (

SI

Appendix, Fig. S2



).

Both antibodies performed well in common epigenetics ap-

plications. They detected histone H3 in Western blotting of the

whole cell extracts, and, in the case of 304M3-B, the intense

histone H3 band was absent in the blot for the extracts from a

Set1-deleted yeast strain (

SI Appendix, Fig. S3

). In ChIP-seq of

HEK293 cells, 304M3-B produced sharp peaks localized in the

promotor regions and 309M3-B produced diffused peaks, and

their locations were mutually exclusive (Fig. 1 E and F, Left),

patterns consistent with the known distribution of these histone

PTM marks (9, 12, 13). As expected for recombinant proteins,

results using different batches of these antibodies were highly re-

producible (Fig. 1F, Right and

SI Appendix, Fig. S3

). Therefore,

these recombinant antibodies represent extensively validated, high-

performance tools for achieving accurate and reproducible results.

Formation of Head-to-Head Dimers That Sandwich the Antigen.

Un-

expectedly, the binding properties of these antibodies differed



substantially, depending on the orientation of the IP assay (Fig. 2A

and


SI Appendix, Fig. S4

). In our standard IP assay, which mimics

the format of the standard immunoprecipitation method (8), a

biotinylated Fab is immobilized on streptavidin-coated beads first,

and a peptide captured by the antibody is quantified using flow

cytometry. In this format, we observed hyperbolic curves consis-

tent with a simple 1:1 binding model. Titrations in the reversed

orientation (i.e., soluble antibodies to a peptide immobilized on

beads) showed sigmoidal curves with a Hill coefficient substantially

Fig. 1.


Exquisite specificity and high affinity of re-

combinant antibodies to H3K4me3 and H3K9me3.

(A) Schematic structure of the IgG. (B and C) Binding

titration curves of the 309M3-B (B) and 304M3-B

(C) antibodies to their cognate peptide and off-

target peptides measured with the peptide IP assay.

The calculated K

D

value to the cognate peptide is



shown. (D) Equal molar amounts of synthetic pep-

tides harboring different PTMs were mixed, and

then peptides were captured with 309M3-B (Top) or

304M3-B (Bottom) were quantified with MS. The

ratio to the input for each peptide is shown. *, The

apparent enrichment of unmodified peptides is

derived from enrichment of the input peptides

(residues 1

–21) harboring H3K9me3 or H3K4me3

that also produce the peptides for H3K4un (residues

3

–8) or H3K9un (residues 9–17), respectively, after



trypsin digestion. (E) Comparison of ChIP-seq data

at the same loci obtained with 304M3-B lot1 and

309M3-B lot1. (F) Scatter plots comparing the nor-

malized read densities (reads per base pair per

million mapped reads) for called peaks of the

dataset with 304M3-B and 309M3-B (Left) and with

different lots of 304M3-B (Right). The square of the

Pearson product-moment correlation coefficient (R

2

)

and the total number of peaks compared (N) are



indicated.

Hattori et al.

PNAS

|

February 23, 2016



|

vol. 113


|

no. 8


|

2093


BIO

CHEMISTRY



greater than unity, indicating cooperating binding, and with much

higher half-saturation concentrations than those from the standard

format (Fig. 2A and

SI Appendix, Fig. S4

).

Strikingly, the crystal structures of 309M3-B and 304M3-B in



complex with peptides corresponding to their respective antigens

revealed that both antibodies formed head-to-head Fab dimers

(Fig. 2B and

SI Appendix, Fig. S4

). Two 309M3-B Fab molecules

bound one H3K9me3 peptide, with no internal symmetry

(Fig. 2B). Similarly, the 304M3-B Fab dimer bound two

H3K4me3 peptides, but with the two molecules related by an

approximately twofold rotational symmetry operation (

SI Ap-


pendix, Fig. S4

). In contrast, the crystal structure of 309M3-B in

complex with trimethylated Lys (i.e., a single amino acid without a

polypeptide chain) did not show dimerization, suggesting that its

dimerization requires peptide residues adjacent to trimethyl Lys

(

SI Appendix, Fig. S4



).

We then confirmed the occurrence of this unusual binding

mode in solution by using size-exclusion chromatography and dy-

namic light scattering. The sizes of the antibody

–peptide complexes

were about twice as large as the antibodies alone (Fig. 2C and

SI

Appendix, Fig. S5



). A 2:1 molar ratio of antibody to peptide was

sufficient to fully induce the size shift of 309M3-B, whereas a 1:1

ratio was required for 304M3-B. The binding stoichiometries in

solution are consistent with those observed in crystals. Also

consistent with the crystal data, trimethyl Lys did not induce the

size shift of 309M3-B (

SI Appendix, Fig. S5

). These results conclu-

sively demonstrated antigen-induced dimerization of 309M3-B and

304M3-B. We term this mode of antigen recognition

“antigen

clasping


” hereafter.

Anti-peptide or anti-small compound antibodies typically have a

deep cleft created by long CDRs (14, 15) (

SI Appendix, Fig. S6

). In

contrast, the antigen-binding sites of our antigen-clasping anti-



bodies are flat, consistent with their short CDRs (Fig. 3A and

SI

Appendix, Fig. S6



), a topography similar to that found for antibodies

to large spherical antigens such as structured proteins. Antigen

clasping by two copies of a flat antigen-binding site created large

interaction surfaces. The interfaces (1,177 Å

2

for the H3K9me3



peptide and 987 Å

2

for the H3K4me3 peptide) (



SI Appendix,

Table S2


) were nearly twice as large as typical peptide

–protein


binding interfaces (16). 309M3-B used a total of 8 CDRs to rec-

ognize the H3K9me3 peptide, and, remarkably, 304M3-B used 12

CDRs (i.e., all CDRs available in the Fab dimer) in binding to two

H3K4me3 peptide molecules (Fig. 3A and

SI Appendix, Fig. S6

).

Therefore, antigen clasping enables antibodies to use most CDRs



and create large interacting surfaces, leading to high affinity and

specificity toward peptide antigens.

Recognition of Trimethylated Lys and Histone N Terminus with Two

Distinct Pockets.

Close inspection of the antibody

–peptide inter-

faces revealed two common features between the two structures.

First, there is an

“aromatic cage” located at the interface between

the heavy and light chains that perfectly fit the trimethylated qua-

ternary ammonium cation of Lys N

e (Fig. 3 B and D and

SI Ap-

pendix, Fig. S6



). Aromatic cages are known binding pockets for

methylated Lys moieties in natural histone reader proteins, in which

methylated ammonium groups interact with the aromatic side

chains mediated by the cation

–π interaction (17, 18). The aromatic

cage in our antibodies is more extensive and optimal for trimethy-

lated Lys than natural counterparts, rationalizing the much higher

ability of our antibodies to distinguish trimethylated Lys from

dimethylated Lys (

SI Appendix, Fig. S7

). Interestingly, Arg8 of

the H3K9me3 peptide fit in the aromatic cage in the second

Fab molecule and made electrostatic interactions with acidic

residues located at the base of the cavity (Fig. 3B). Occupation

of an aromatic cage by the Arg side chain has been observed for the

SET domain of Ezh2 (19), suggesting that aromatic cages have

inherent affinity to Arg.

Second, a binding pocket formed by residues in CDRL1 and

L2 recognized the N-terminal two residues (Ala1 and Arg2) of

the histone (Fig. 3 B and C and

SI Appendix, Fig. S6

). Mutation

Fig. 2.

Cooperative dimerization of two antigen-binding sites. (A) Effects of



the assay orientation on the binding reactions of 309M3-B. (Top) Scheme and

titration of a soluble peptide to immobilized antibodies: i.e., the standard IP

assay. (Bottom) Scheme and titration in the reversed orientation where a

soluble Fab protein is added to immobilized peptide. The titration data in the

Top panel is the same as that shown in Fig. 1B. The curves show the best fit

of the Hill equation, with the values of the Hill coefficient,

α, indicated. Note

the different concentration ranges on the horizontal axis. Data shown are

from triplicate measurements. (B) The overall structures of 309M3-B in com-

plex with the H3K9me3 peptide. The scheme depicts the binding mechanism

of the 309M3-B antibody that forms asymmetric homodimerization with the

H3K9me3 peptide. The heavy and light chains in Fab 1 are shown in red and

pink, respectively, and those in Fab 2 (the dimerization partner of Fab1) are

shown in blue and cyan, respectively. (C) Dimerization of 309M3-B in solution

analyzed using gel filtration chromatography (graph) and dynamic light

scattering (table). The Fab sample was mixed with the peptides with the in-

dicated ratios and analyzed. Arrows indicate the peak positions of calibration

proteins (

γ-globulin, ovalbumin, and myoglobin, from left to right). The

complete dataset for dynamic light scattering is in

SI Appendix, Fig. S5

.

2094



|

www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1522691113

Hattori et al.


studies confirmed the importance of both the aromatic cage and

A

1



R

2

-binding pocket for antigen recognition (Fig. 3 C and D and



SI Appendix, Figs. S6 and S8

).

Antigen Clasping Enables Fine Control of the Distance Between the



Two Pockets.

Remarkably, the peptides bound to the A

1

R

2



-binding

pocket in one Fab and to the aromatic cage in the other in both

structures, thereby bridging the two Fab molecules across the dimer

interface (Fig. 3 A and B and

SI Appendix, Fig. S6

). We confirmed

this binding mode by constructing an active heterodimer with two

complementary

“half-site” mutants, one containing a mutation in the

aromatic cage and the other containing a mutation in the A

1

R

2



-binding

pocket (Fig. 4A). Although the homodimers containing mutation in the

aromatic cage (Y58

H

A) or in the A



1

R

2



-binding site (D51

L

A/D53



L

A)

were inactive, the heterodimer of the two mutants regained binding.



Together, these features rationalize the unusual cooperative binding and

high functionality of these antibodies.

304M3-B and 309M3-B achieved their high sequence speci-

ficity to different Kme3 marks using a set of common recognition

motifs: i.e., the aromatic cage and the A

1

R



2

-binding pocket. Curi-

ously, although these motifs are conserved in these antibodies (and

the starting clone) because we did not mutate residues forming

these pockets (

SI Appendix, Fig. S1

), their sequence specificity

profiles are essentially mutually exclusive (Fig. 1 B and C). Super-

position of the two structures revealed a large difference in the

relative position of the two Fab molecules (Fig. 4B), with a con-

comitant alteration in the spacing between the aromatic cages

and the A

1

R

2



-binding pockets. The span between the two pockets

seems optimal for the H3K9me3 peptide in the 309M3-B complex

(

∼20 Å) and for the H3K4me3 peptide in the 304M3-B complex



(

∼7 Å), but much too short for other major Lys modification sites

(e.g., H3K27, H3K36, and H4K20) (Fig. 4B), explaining their spec-

ificity profiles. Likewise, the need for optimizing the distance between

the two pockets rationalizes why the peptide is bound across two Fab

molecules because this distance within a single Fab molecule (

∼13 Å)

is invariant and too large for H3K4me3 and too small for H3K9me3.



Therefore, we propose that the dimerization and the strategically

positioned two recognition motifs in these antibodies play important

roles in highly specific recognition of the histone marks.

The structures suggest that antigen clasping is obligatory for

these antibodies to achieve high affinity and high specificity.

Mutation of a single residue (two for the Fab dimer) in the Fab

Fab interface abolished antigen binding, indicating the impor-



tance of this contact in achieving the observed mode of peptide

recognition (Fig. 4C and

SI Appendix, Fig. S9

). Interestingly, the

ability to form a peptide-induced dimer emerged in the directed

evolution process. The Fab

–Fab contacts in the two antibodies

are different and involve residues in CDRH2 that were altered with

respect to the starting clone (Fig. 4C and

SI Appendix, Fig. S9

). In

contrast to these two antibodies, the previously developed anti-



body for H3K9me3, 309M3-A, did not exhibit antigen clasping

although it was isolated from the same phage-display library and it

differs in only 10 CDR positions from 309M3-B (

SI Appendix,

Figs. S1 and S5

). It is notable that mutations required for antigen

clasping are within CDRs, regions that are highly varied in natural

antibodies, suggesting that these antibodies and other yet-to-be-

identified dimerizing Fab molecules could exist in the natural

immune system.

A

“Long-Neck” Format Promotes Antigen Clasping.



We then designed

an antibody format, termed

“long-neck antibody,” to facilitate

antigen clasping. We reasoned that the format of our phage

Fig. 3.

Recognition of a single H3K9me3 peptide at



the interface of two antigen-binding sites. (A) In-

teractions of the H3K9me3 peptide with the Fab

dimer. (Center and Right) The peptide-recognition

interface in an open book manner. CDRs that in-

teract with the peptide are labeled in yellow. (Right)

Key elements in Fab1 and Fab2. (B) Details of the

antibody

–peptide interaction interface. The amino

acid residues are colored in the same manner as in

Fig. 2B. Peptide residue numbers are in red. The

A

1

R



2

-binding pocket and the aromatic cage are

enclosed in a gray shade. Polar interactions are

marked as dashed lines. Residues mutated with re-

spect to the lead antibody, 4-5, are labeled in blue.

(C) A close-up view of the recognition of the A

1

R

2



motif with its binding pocket in 309M3-B (Left). The

D51


L

A/D53


L

A double mutant abolishes binding as

tested with the peptide IP assay (Right). (D) The ar-

omatic cage in 309M3-B. (Left) The side chains that

create the aromatic cage and trimethylated N

e of


Lys9. (Right) The effects of alanine mutations of

these residues tested with phage ELISA. Binding data

shown here are from triplicate measurements. See

SI

Appendix, Fig. S8



for additional data.

Hattori et al.

PNAS

|

February 23, 2016



|

vol. 113


|

no. 8


|

2095


BIO

CHEMISTRY



display system, where scFv molecules are tethered to a phage coat

protein via a long linker, enabled us to identify these unusual

antibodies. Thus, we connected an antigen-binding module (scFv

in this case) to Fc with a 17-residue linker (Fig. 5A). We chose

scFv over Fab because the use of Fab would require a much

longer linker. As expected, the long-neck scFv-Fc antibodies

did not show cooperativity in the reversed IP assay, demonstrating

that this format promotes antigen clasping within a single antibody

molecule (Fig. 5B and

SI Appendix, Fig. S10

). In contrast, the

same antigen-binding sites in the standard IgG format showed

weaker binding and strong cooperativity. The long-neck scFv-Fc

antibodies worked well in Western blotting and immunostaining

analyses at high dilutions (

SI Appendix, Fig. S10

), further sup-

porting the potency of the long-neck scFv-Fc format.

Discussion

In this study, we generated recombinant antibodies to H3K4me3

and H3K9me3 that performed well in epigenetics applications,

successfully determined the crystal structures of antibody

–peptide

complexes, and elucidated how these antibodies achieved high

specificity and high affinity to challenging targets, histone tails

containing Kme3 marks. These highly validated recombinant

antibodies, as well as future recombinant antibodies engineered

based on the mechanistic insights gained in this work, will pro-

vide the epigenetic research community with a set of standard

reagents that will improve data accuracy and reproducibility.

Antigen clasping is highly unusual among known antibody

structures. Dimerization of Fab molecules in crystals is observed

in cases where the antigen itself has internal twofold symmetry,

as expected (20, 21), but histone peptides described here do

not form dimers or have internal symmetry. Antigen clasping is

also distinct from the binding mode of the bispecific, chelating

recombinant antibody (CRAb) because a CRAb is constructed

by linking two different scFv molecules (22) and the two scFv

units bind to nonoverlapping epitopes of a protein. Among

∼1,200


structures of antibody

–antigen complexes in the Protein Data

Bank, we found a single example, anti

–C-myc antibody 9E10,

that seems to exhibit antigen clasping. However, the binding

mode of 9E10 conforms to the convention of anti-peptide an-

tibodies because one Fab dominates peptide recognition by

capturing the peptide into a deep cleft created with long CDRs,

and this antibody showed no cooperative binding (23). By

contrast, in our antibodies, two Fab molecules synergistically

contribute to peptide recognition. Nevertheless, the 9E10 struc-

ture supports the view that natural antibodies have an inherent

capacity to clasp an antigen.

What factor restricts the immune systems from producing

antibodies exhibiting antigen clasping? Or have such antibodies

been simply overlooked because the existing paradigm of anti-

body

–antigen interaction is so well established? In conventional



antibodies, two Fab segments are connected with disulfide bonds

in the hinge region located between the Fab and Fc regions

(Fig. 1A). This architecture makes the antigen-binding sites in

the two Fab regions face opposite directions to each other. The

distance between the C termini of two Fab molecules in IgG

(

∼15 Å between the C termini of the CH



1

domains) (Fig. 1A) is

much too short for forming a head-to-head dimer (

∼120Å) (Fig.

2B) (24, 25). Thus, it is sterically difficult for the two Fab arms of

a single IgG molecule to form a head-to-head dimer. Indeed,

309M3-B in the IgG format still shows cooperative binding with

low affinity in the reverse IP assay, indicating dimer formation

between two IgG molecules (Fig. 5 A and B). Such intermo-

lecular dimerization leads to low efficacy, diminishing the likelihood

of isolating this type of antibodies. Uncontrolled interaction be-

tween antigen-binding sites may promote aggregation, perhaps

leading to low probability of generating functional antibodies.

In addition to the geometrical restrictions described above, a

clasping antibody requires a single antigen-binding unit with

Fig. 4.


Structural basis for the exquisite sequence specificity of the

antibodies. (A) Two complementary half-site mutants retained antigen-

binding function by forming a heterodimer. The addition of the 309M3-B

A1R2-binding site mutant to yeast cells expressing the 309M3-B aromatic

cage mutant resulted in

“heterodimer” formation only in the presence of

H3K9me3 peptide. The binding of the peptide was detected in the same

manner as the peptide IP assay. (B) Superposition of 309M3-B (dark pur-

ple) and 304M3-B (gray) using the variable domains of Fab 1 as the

common element (Left). Only the variable domains are shown for clarity.

The H3K9me3 and H3K4me3 peptides are shown as stick models in red

and yellow, respectively. Only one molecule for H3K4me3 peptide is

shown for clarity. (Right) A comparison of the bound peptides using

superposition of the aromatic cages. The aromatic cages of 304M3-B

and 309M3-B are shown in light and dark green, respectively, and resi-

dues in the A

1

R

2



-binding pockets are shown in magenta. A1, R2,

and trimethylated lysine residues in the H3K4me3 peptide are shown in

orange, and their counterparts in the H3K9me3 peptide are shown

in yellow. The C

α atoms of the R2 and Kme3 residues are shown as

spheres, and the distances between these atoms in the two peptides

are indicated. (C ) Antibody

–antibody contacts between two 309M3-B

molecules. Polar interactions are marked as dashed lines. The color

scheme is the same as in Fig. 2B. The residues that are different from

clone 4-5 are labeled in blue. See

SI Appendix, Fig. S9

for more detail.

Mutation of D53

H

abolishes antigen biding as tested with the peptide IP



assay (Right).

2096


|

www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1522691113

Hattori et al.


binding interfaces that recognize different parts of the peptide,

as well as the antibody/antibody contacts that are not ener-

getically unfavorable. These considerations rationalize why

antibodies exhibiting antigen clasping are rare.

Whereas generation of homodimeric clasping antibodies like

those reported here may be challenging, one can envision con-

structing clasping antibodies with two different antigen-binding

units. One could iteratively engineer a first unit binding to the

antigen and then a second unit binding to the complex of the first

unit and the antigen to achieve clasping. Indeed, our group has

generated a class of synthetic binding proteins termed

“affinity

clamps

” by using a natural peptide-binding domain as the first unit



and a synthetic binding protein (

“monobody”) as the second unit

(26). The successes of affinity clamp engineering (26, 27) support

the feasibility of generating heterodimeric clasping antibodies.

This study has expanded the paradigm for antibody

–antigen


recognition and identified an evolutionary restriction contribut-

ing to the rarity of antibodies that form Fab dimers. Antigen

clasping doubles the size of the antigen recognition interface and

allows for the formation of extensive interactions that completely

surround a small antigen. We anticipate that antibody formats en-

abling antigen clasping (e.g., the long-neck format) and iterative

selection strategies will have a strong impact on unleashing mo-

lecular recognition potentials of antibodies toward currently chal-

lenging targets, including histone PTMs and small compounds.

Materials and Methods

Selection, purification, and characterization of recombinant antibodies to

histone PTMs were performed essentially as described previously (9). IP-MS,

ICeChIP, and ChIP-seq were performed following published methods (11, 28,

29). Further details on the materials and methods used in this study are

described in

SI Appendix

.

ACKNOWLEDGMENTS. We thank J. Osipiuk for assistance with data



collection at the Advanced Photon Source, Drs. A. Gupta and S. Tanaka for

assistance with X-ray structure determination, Dr. D. Kovar for access to a

cell homogenizer, and Drs. A. Kossiakoff and M. Lugowski for access to cell

culture equipment. This work was supported by National Institutes of Health

(NIH) Grants R21 DA025725 and RC1 DA028779 (to S.K.) and GM067193

(to N.L.K.). B.D.S. acknowledges funding from the W. M. Keck Foundation.

S.K., A.J.R., and N.L.K. acknowledge funding from the Chicago Biomedical

Consortium, with support from the Searle Funds at the Chicago Community

Trust. We acknowledge the use of the University of Chicago Genomics, Flow

Cytometry, and Biophysics core facilities that are supported by the University

of Chicago Comprehensive Cancer Center under NIH Grant P30 CA014599.

This research used resources of the Advanced Photon Source, a US De-

partment of Energy (DOE) Office of Science User Facility operated for the

DOE Office of Science by Argonne National Laboratory under Contract DE-

AC02-06CH11357.

1. Porter RR (1958) Separation and isolation of fractions of rabbit gamma-globulin

containing the antibody and antigenic combining sites. Nature 182(4636):670

–671.


2. Bostrom J, et al. (2009) Variants of the antibody herceptin that interact with HER2 and

VEGF at the antigen binding site. Science 323(5921):1610

–1614.

3. Holliger P, Hudson PJ (2005) Engineered antibody fragments and the rise of single



domains. Nat Biotechnol 23(9):1126

–1136.


4. Strahl BD, Allis CD (2000) The language of covalent histone modifications. Nature

403(6765):41

–45.

5. Kouzarides T (2007) Chromatin modifications and their function. Cell 128(4):693



–705.

6. Egelhofer TA, et al. (2011) An assessment of histone-modification antibody quality.

Nat Struct Mol Biol 18(1):91

–93.


7. Fuchs SM, Strahl BD (2011) Antibody recognition of histone post-translational modi-

fications: Emerging issues and future prospects. Epigenomics 3(3):247

–249.

8. Nishikori S, et al. (2012) Broad ranges of affinity and specificity of anti-histone anti-



bodies revealed by a quantitative peptide immunoprecipitation assay. J Mol Biol

424(5):391

–399.

9. Hattori T, et al. (2013) Recombinant antibodies to histone post-translational modifi-



cations. Nat Methods 10(10):992

–995.


10. Diskin R, et al. (2011) Increasing the potency and breadth of an HIV antibody by using

structure-based rational design. Science 334(6060):1289

–1293.

11. Grzybowski AT, Chen Z, Ruthenburg AJ (2015) Calibrating ChIP-seq with nucleosomal internal



standards to measure histone modification density genome wide. Mol Cell 58(5):886

–899.


12. Wysocka J, et al. (2005) WDR5 associates with histone H3 methylated at K4 and is

essential for H3 K4 methylation and vertebrate development. Cell 121(6):859

–872.

13. Wysocka J, et al. (2006) A PHD finger of NURF couples histone H3 lysine 4 trimethy-



lation with chromatin remodelling. Nature 442(7098):86

–90.


14. Vargas-Madrazo E, Lara-Ochoa F, Almagro JC (1995) Canonical structure repertoire of

the antigen-binding site of immunoglobulins suggests strong geometrical restrictions

associated to the mechanism of immune recognition. J Mol Biol 254(3):497

–504.


15. Collis AV, Brouwer AP, Martin AC (2003) Analysis of the antigen combining site:

Correlations between length and sequence composition of the hypervariable loops

and the nature of the antigen. J Mol Biol 325(2):337

–354.


16. London N, Movshovitz-Attias D, Schueler-Furman O (2010) The structural basis of

peptide-protein binding strategies. Structure 18(2):188

–199.

17. Taverna SD, Li H, Ruthenburg AJ, Allis CD, Patel DJ (2007) How chromatin-binding



modules interpret histone modifications: Lessons from professional pocket pickers.

Nat Struct Mol Biol 14(11):1025

–1040.

18. Hughes RM, Wiggins KR, Khorasanizadeh S, Waters ML (2007) Recognition of tri-



methyllysine by a chromodomain is not driven by the hydrophobic effect. Proc Natl

Acad Sci USA 104(27):11184

–11188.

19. Jiao L, Liu X (2015) Structural basis of histone H3K27 trimethylation by an active



polycomb repressive complex 2. Science 350(6258):aac4383.

20. Fuh G, et al. (2006) Structure-function studies of two synthetic anti-vascular endothelial

growth factor Fabs and comparison with the Avastin Fab. J Biol Chem 281(10):6625

–6631.


21. Hillig RC, et al. (2008) Fab MOR03268 triggers absorption shift of a diagnostic dye via

packaging in a solvent-shielded Fab dimer interface. J Mol Biol 377(1):206

–219.

22. Neri D, Momo M, Prospero T, Winter G (1995) High-affinity antigen binding by che-



lating recombinant antibodies (CRAbs). J Mol Biol 246(3):367

–373.


23. Krauss N, et al. (2008) The structure of the anti-c-myc antibody 9E10 Fab fragment/

epitope peptide complex reveals a novel binding mode dominated by the heavy chain

hypervariable loops. Proteins 73(3):552

–565.


24. Saphire EO, et al. (2001) Crystal structure of a neutralizing human IGG against HIV-1:

A template for vaccine design. Science 293(5532):1155

–1159.

25. Harris LJ, Skaletsky E, McPherson A (1998) Crystallographic structure of an intact IgG1



monoclonal antibody. J Mol Biol 275(5):861

–872.


26. Huang J, Koide A, Makabe K, Koide S (2008) Design of protein function leaps by

directed domain interface evolution. Proc Natl Acad Sci USA 105(18):6578

–6583.

27. Yasui N, et al. (2014) Directed network wiring identifies a key protein interaction in



embryonic stem cell differentiation. Mol Cell 54(6):1034

–1041.


28. Zheng Y, Thomas PM, Kelleher NL (2013) Measurement of acetylation turnover at distinct

lysines in human histones identifies long-lived acetylation sites. Nat Commun 4:2203.

29. Brand M, Rampalli S, Chaturvedi CP, Dilworth FJ (2008) Analysis of epigenetic modifications

of chromatin at specific gene loci by native chromatin immunoprecipitation of nucleo-

somes isolated using hydroxyapatite chromatography. Nat Protoc 3(3):398

–409.


Fig. 5.

An antibody format that promotes head-to-head dimerization. (A)

Schematic structure of the long-neck scFv-Fc format and the IgG format of

an antibody exhibiting antigen clasping. (B) The reversed IP assay of the

long-neck scFv-Fc and the IgG formats of 309M3-B. The long-neck scFv-Fc did

not show strong cooperativity whereas the IgG did. Compare these results

with Fig. 2A. The curves show the best fit of the Hill equation with the values

of the Hill coefficient,

α, indicated. All binding data shown here are from

triplicate measurements.

Hattori et al.

PNAS


|

February 23, 2016

|

vol. 113


|

no. 8


|

2097


BIO

CHEMISTRY



Yüklə 151,91 Kb.

Dostları ilə paylaş:




Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©www.azkurs.org 2024
rəhbərliyinə müraciət

gir | qeydiyyatdan keç
    Ana səhifə


yükləyin